马玉兰，曹 萍,2,3，马志杰,3*，陈生梅,2,3，李瑞哲,2,3，刘书杰，郭东风

(1.青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016；2.农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室，西宁 810016；3.青海省高原家畜遗传资源保护与创新利用重点实验室，西宁 810016；4.青海省格尔木市唐古拉山镇兽医站，青海 格尔木 816099)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及其毗邻高地的特有牛种，为当地牧民提供肉、奶、毛、绒、皮和燃料等生活必需品，对青藏高原多元民族文化的发展起着至关重要的作用[1]。唐古拉山镇位于青海省西南部，其西、南与西藏那曲藏族自治州毗邻，东、北隔马兰马拉山与当曲和玉树藏族自治州的治多、杂多两县接壤，该地区地势高峻,海拔4 500 m以上,属三江源自然保护区，年均气温-2.8 ℃[2]。据研究报道[3]，唐古拉山牦牛群体中含野血牦牛的比例高达25%以上，因此，唐古拉山牦牛具有抗逆性强、生长发育速度快、产肉量高等特点。据统计结果显示[4]，唐古拉山镇共有草场721.13 hm2，牦牛2万多头，其中能繁母畜占50%以上，拥有丰富的牦牛遗传资源。

线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)具有结构简单、突变率高和不容易发生重组等特点，因此被广泛运用于哺乳动物母系遗传多样性、起源进化、群体结构及系统发育等研究[5]。当前，基于mtDNA D-loop区、Cyt b和16S rRNA等基因以及mtDNA全序列核苷酸变异对野牦牛及部分家牦牛品种(群体)的母系遗传多样性、群体结构及系统发育关系等前人已做了大量的研究。赖松家等[6]、郭松长等[7]、宋乔乔等[8]、Yue X P等[9]、Li G Z等[10]、李静等[11]基于mtDNA D-loop序列变异对我国多个家、野牦牛品种(群体)分析表明，大多数牦牛品种(群体)都存在2个高度分化的母系支系且具有丰富的母系遗传多样性，提示牦牛存在2个母系起源。与此同时，Wang Z F等[12]、Wang X D等[13]、Ma Z J等[14]和李广祯等[15]对我国部分牦牛品种(群体)mtDNA全序列遗传变异的分析表明，家、野牦牛品种(群体)具有丰富的母系遗传多样性，但系统发育分析确定了3个大的母系支系，提示牦牛有3个母系起源。然而,当前尚未见对青海省唐古拉山牦牛群体母系遗传方面的研究报道。本研究对唐古拉山牦牛群体mtDNA D-loop区序列变异进行母系遗传多样性分析，以揭示其群体遗传结构和系统发育分析，明确唐古拉山牦牛品种分子遗传多样性、遗传关系及分化状况，为开展牦牛分子遗传资源的评估、保护与利用以及牦牛的品种培育和改良提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 采样与基因组DNA提取

本实验采集了来自青海省海西蒙古族藏族自治州格尔木市唐古拉山镇52头牦牛的颈静脉血，ACD抗凝后带回实验室。采样采取随机抽样法，样本采集前询问牧户、查阅牦牛群体的系谱记录，确保样品具有代表性。使用基因组DNA试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取基因组DNA后，双重检测DNA浓度和纯度后-20 ℃保存备用。。

1.2 引物合成、PCR扩增与测序

参照先前在野牦牛[14]中的研究报道，合成一对引物用以扩增唐古拉山牦牛的mtDNA D-loop区序列，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中包括上游引物(PF)：5′-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3′和下游引物(PR)为5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。

PCR扩增体系(25 μL)：超纯水9.5 μL，2xPremix 12.5 μL，基因组DNA和上、下游引物各1 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，31个循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，后送PCR纯化产物在北京擎科生物科技有限公司进行双向测序。

1.3 数据分析

用BioEdit 7.2.5[16]和DnaSP 5.10.01[17]软件进行核苷酸多序列比对分析，后确定唐古拉山牦牛群体的核苷酸序列多态位点。Arlequin 3.5.2.2[18]软件用来计算其单倍型多样度和核苷酸多样度大小，以揭示群体的母系遗传多样性水平。使用MEGA 5.05[19]软件基于邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统发育树以探究唐古拉山牦牛单倍型(组)间的系统发育关系，用以揭示其母系遗传背景。

2 结果与分析

2.1 唐古拉牦牛mtDNA D-loop区序列变异分析

52头唐古拉山牦牛619 bp mtDNA D-loop区序列分析显示，其A+T含量为58.57%，G+C含量为41.43%，存在明显的核苷酸组成偏倚性。序列比对分析排除2处插入(缺失)位点后，共检测到31处多态位点；在31处多态位点中，包括5处单一多态位点(即85、174、254、255和445位点)和26处简约信息位点(即21、60、67、99、114、120、175、182、183、193、202、219、222、224、235、236、237、243、252、260、282、317、318、324、427和465位点)(图1)。研究确定了13种单倍型，其中20个个体共享H1单倍型，其为优势单倍型。6个个体共享H7和H9单倍型，4个个体共享H2和H10单倍型，3个个体共享H3和H11单倍型，其余单倍型均由1个个体共享。

注：N表示共享同一种单倍型的个体数；“.”表示与H1单倍型序列中的核苷酸相同；Hg表示单倍型组类型。

2.2 唐古拉山牦牛的母系遗传多样性分析

多序列比对分析计算结果表明，唐古拉山牦牛群体mtDNA D-loop区核苷酸多样度和单倍型多样度分别为0.007±0.004和0.821±0.043。与已报道的野牦牛及我国其他18家牦牛品种相应遗传多样性指数值相比(表1)，唐古拉山牦牛群体的遗传多样性指数值均较低，表明其母系遗传多样性水平较低。

表1 唐古拉山牦牛与我国其他19个家、野牦牛品种(群体)母系遗传多样性指数值比较

2.3 唐古拉山牦牛的系统发育分析

以先前报道中代表牦牛3个母系支系的D-loop区序列(即支系I(GenBank No.：FJ548844)、支系II(GenBank No.：FJ548843)和支系III(GenBank No.：DQ139202))作为参考序列[14]，并将美洲野牛(Bison bison)的D-loop序列(GenBank No：EU177871)作为外群，NJ法构建系统发育树。系统发育结果显示：唐古拉山牦牛的13种单倍型序列和支系I、支系II的2条参考序列分别聚在一起，形成2个大的母系遗传分支(图2)，其中支系Ⅰ包括单倍型H1、H2、H6、H7、H8、H11、H12、H13、H10、H4、H5和H9，占92.3%；而支系Ⅱ包括单倍型H3，占7.6%。13种单倍型属于4种单倍型组，分别为A、B、D和E(图2)，且分别占69.2%、15.3%、7.6%和7.7%；其中A单倍型组包括9种单倍型(即H1、H2、H6、H7、H8、H11、H12、H13和H10单倍型)，B单倍型组只有2种单倍型(即H5和H9单倍型)，而D和E单倍型组分别包括单倍型H3和H4。

图2 唐古拉山牦牛系统发育分析

3 讨 论

遗传多样性能够有效反映动物群体遗传变异的丰富程度，单倍型多样度和核苷酸多样度是衡量动物分子遗传多样性水平的重要指标[28]。先前的研究表明，野牦牛及我国多数家牦牛品种都具有丰富的母系遗传多样性，其中野牦牛群体的单倍型多样度在0.957～0.967之间[9,12,14,27]，而家牦牛品种的单倍型多样度在0.621～1.000[6-8,10-11,13,19-26]之间。在本研究中，唐古拉山牦牛群体的核苷酸多样度值和单倍型多样度分别为0.007±0.004和0.821±0.043。与我国其他家牦牛品种(群体)(即天祝、甘南、九龙、类乌齐、帕里、斯布、昌台、金川、麦洼、木里、中甸、巴州、青海高原、环湖、大通、雪多、玉树、帕米尔)和野牦牛相比[6-14,19-27]，唐古拉山牦牛的群体核苷酸多样度和单倍型多样度值均较低，表明唐古拉山牦牛群体具有较贫乏的母系遗传变异，遗传多样性水平较低。究其原因，可能与该群体所处的生存环境、选育历史及选择程度、遗传漂变等因素相关，究其原因有待今后作进一步深入探究。

牦牛的系统发育研究可以明确其进化历史和遗传背景，有利于牦牛遗传资源的保护和开发利用[14]。先前多数针对我国野牦牛及家牦牛品种(群体)的系统发育研究显示：牦牛拥有2个母系支系，推测可能有2个母系起源[6-8,10-11,13,19-26]。然而，近年来部分研究者如Wang Z F等[12]、Wang X D等[13]和Ma Z J等[14]基于线粒体基因组对我国家、野牦牛的系统发育分析表明，牦牛拥有3个母系支系，其中共享第Ⅰ、Ⅱ支系的家、野牦牛个体较多，而第Ⅲ支系中仅有少量野牦牛和雪多、格尔木牦牛个体的存在，推测牦牛有3个母系起源。在本研究中，唐古拉山牦牛的13种单倍型分布在A、B、D和E 4种单倍型组中，所占比例依次为69.2%、15.3%、7.6%和7.6%，说明A单倍型组是其优势单倍型组。同时，这13种单倍型聚为2个大的母系支系，故推测唐古拉山牦牛有2个母系起源，这与野牦牛及多数家牦牛品种(群体)的研究结果基本一致。

4 结 论

唐古拉山牦牛群体核苷酸多样度为0.007±0.004，单倍型多样度为0.821±0.043，其母系遗传多样性水平较低，其中单倍型H2为优势单倍型，A单倍型组是其优势单倍型组，由2个母系支系组成，推测其可能有2个母系起源。