徐辰，汤加，董赟，谈晓东，陈昊，周春刚

心肌炎是指心肌局限性或弥漫性炎性病变为主要表现的疾病。多数情况下，本病会自行消退，但在易感人群中，可缓慢发展，导致心肌组织纤维化，肥大和心肌细胞凋亡，最终演变为扩张性心肌病，继而发展为心力衰竭[1]。临床观察和动物实验研究表明，感染诱发的自身免疫反应在心肌炎的发生发展过程中发挥重要作用，导致自身免疫耐受受到破坏和自身反应性T细胞活化[2]。现代医学治疗心肌炎主要采用休息、抗炎、抗病毒及对症治疗[3]，虽然免疫抑制疗法和细胞疗法取得了一定进展[4,5]，但效果不理想，常有不同程度的不良反应。中医药治疗心肌炎从整体观入手，以方剂为载体，通过多靶点多组分作用，融拮抗、补充、整合、调节等多种功效而起到平衡免疫功能等各项生理功能，使之恢复正常[6,7]。实验性自身免疫性心肌炎（EAM）是一种CD4+T细胞介导的炎症性心肌病的小鼠模型[8]，本研究通过实验性自身免疫性心肌炎模型模拟自身免疫性心肌炎的发生过程，观察炙甘草汤对实验性自身免疫性心肌炎的治疗效果，并探讨可能的作用机制，为治疗自身免疫性心肌炎提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物重组α肌球蛋白重链多肽（MyHC-α，614-629） Ac-RSLKLMATLFSTYASADR-OH由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；完全弗氏佐剂（SIGMA，批号：F5881）；强的松片（5 mg/片，上海上药信谊药厂有限公司）。炙甘草汤出自东汉著名医家张仲景《伤寒论·辨太阳病脉证并治》第177条：“甘草四两炙（12 g）、生姜三两（9 g）、人参二两（6 g）、生地黄一斤（30 g）、桂枝三两去皮（9 g）、阿胶二两（6 g）、麦门冬半升去心（10 g）、麻仁半升（10 g）、大枣三十枚擘（10枚）上九味，以清酒七升，水八升，先煮八味，取三升，去滓，纳胶烊尽”，炙甘草汤由无锡市中医院中药煎药中心煎制。

1.2 试剂与设备酶标仪（型号：ELx 50，美国 Bio Tek）；流式细胞仪（型号：FCM calibor,美国 BD）；荧光显微镜（型号：CX51，日本Olympus）；Luminex流式荧光检测系统（型号：Luminex200 美国 ）；苏木素伊红试剂盒（型号：C0105，碧云天生物技术有限公司）；小鼠多细胞因子分析试剂盒（批号：L125974，美国R＆D）；抗小鼠IL17-PE、IL4-APC、IFNγ-Cy5和CD4- FITC抗体（美国BD）

1.3 实验动物和模型建立

1.3.1 实验动物分组7周龄SPF级BALB/c品系雄性小鼠40只，体重20～25 g，由江苏省血吸虫与寄生虫病防治所提供（江苏，无锡）。动物研究按照江苏省动物伦理委员会相关《实验室动物使用和保护指南》经无锡中医院伦理委员会批准（No.TCM-LAEC2016016）。于室温25℃，湿度55%～65%，自适应1周后，随机分成四组：空白对照组，EAM组，炙甘草汤组和强的松组。

1.3.2 小鼠自身免疫性心肌炎（EAM）模型建立采用重组α肌球蛋白重链多肽（MyHC-α），终浓度为（2 mg/ml）与完全弗氏佐剂等量混合成油状，双足底注射，每只小鼠的注射剂量为200 μg，分别在第0 d和第7 d免疫EAM组、炙甘草汤组和强的松组的小鼠。空白对照组同时注射等剂量的完全弗氏佐剂[8]。MyHC-α的表位有心脏特异性，在动物模型中有高度免疫原性，且与人体内的自身抗体和T细胞介导的心肌炎有关[9]。

1.3.3 动物给药实验期间小鼠常规饲料喂养，在免疫第8 d采用灌胃给药[10]，炙甘草汤与强的松剂量均根据成人用量，通过动物剂量换算公式等效剂量换算，炙甘草汤组生药量为22.76 g/kg，1/d，强的松组药量为7.6 mg/kg，1/d，共给药2周。空白对照组和EAM组给予等量生理盐水。以21 d为观察终点，腹腔注射麻醉小鼠并行后续实验。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 心脏质量指数在第14 d给药后，称得各组小鼠体重后腹腔注射3%戊巴比妥钠（45 mg/kg），将麻醉后的小鼠腹部朝上固定于手术台上，打开胸腔，取心脏组织，将其注入盛有无菌生理盐水的培养皿中，生理盐水反复冲洗，滤纸吸干水分，称重并计算心脏质量指数。取左心室部位心肌组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，余下称重并于-80℃冰箱保存。

1.4.2 心肌病理学检测取左心室部位心肌，放入10%中性福尔马林溶液中固定8～12 h，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后切片，脱蜡后用苏木素-伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察心肌病理学变化并拍照。

1.4.3 流式液相多重蛋白定量技术检测心肌组织匀浆液中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-10、IL-1α、IL-6、TNF-α水平 取-80℃冰箱保存的称重心肌组织匀浆处理，12000 g，20 min离心取上清。取出试剂盒在室温放置30 min，其中包括有预混的特异性抗体微珠混合物，预混的检测抗体混合物，标准蛋白混合物和过滤型96孔微孔板等。标准曲线的制备：标准蛋白混合物用稀释溶液重悬，室温静置15 min，将其进行梯度稀释制成标准品，每孔加入混合微球50 μl和标准品50 μl。实验样品孔加入50 μl混合微球和50 μl充分混匀的匀浆液上清，室温孵育2 h后，利用负压装置将剩余液体通过滤膜滤去。加入400 μl清洗液，用负压装置滤去清洗液，该步骤重复三次。每孔加入检测抗体混合物150 μl，轻轻震荡混匀，室温孵育1 h，震荡重悬微球，上机检测。

1.4.4 流式细胞术检测EAM脾脏CD4+T细胞亚群脾脏取材放入细胞筛中，取干净的注射器，用其按压处的末端对组织进行碾压，并用生理盐水反复冲洗，收集冲洗液，加入红细胞裂解液2 min后，2000 r/min离心10 min，弃去上清液，4℃下10 g/L多聚甲醛溶液固定10 min，洗涤，4℃过夜；实验步骤严格按照说明书进行操作，采用流式细胞仪检测分析。辅助性T细胞（Th）群通过CD4直方图设门区分，最终以散点图IL-4、IFN-γ和IL-17染色阳性细胞群表示Th1细胞、Th2细胞和Th17细胞。

1.7 统计学方法实验数据采用SPSS 23.0软件分析处理。计量数据结果采用均值±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态和心脏质量指数比较空白对照组小鼠反应较敏感，活泼，饮食正常；EAM组、炙甘草汤组及强的松组小鼠活动度降低，饮食减少。在给药14 d后分别处死各组小鼠，进行体重及心脏称重，并计算心脏质量指数。在终体重、心脏质量及心脏质量指数等方面相比，各组间差异无统计学意义（P＞0.05），表1。

表1 各组小鼠体重、心脏质量及其心脏质量指数比较

2.2 各组小鼠心肌组织病理学改变在给药14 d后处死各组小鼠，通过心肌组织切片HE染色观察干预效果。结果显示，与空白对照组相比，EAM模型组小鼠心肌呈现典型的心肌炎改变，表现为心肌间质增宽，心肌间质水肿，心内膜下及心肌间质弥漫性炎症细胞浸润。炙甘草汤组相较于EAM组，心肌内膜下炎症细胞浸润明显减少，水肿显著减轻，抑制效果与强的松组相似，图1。

图1 各组小鼠21 d后心肌组织HE染色结果（100×）

2.3 各组小鼠心肌组织细胞因子水平比较与空白对照组比较，EAM模型鼠心肌组织匀浆中细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-1α水平呈显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图2，表2）。同时，炙甘草汤组心肌组织匀浆中IFN-γ、IL-6、IL-1α水平较EAM组有显著下降（P＜0.05），提示炙甘草汤可显著降低EAM早期阶段心肌组织中炎症因子的表达水平，一定程度上能够抑制心肌炎的发生发展。而相较于EAM组，强的松组仅IL-6水平有显著性降低（P＜0.05），提示改善炎症细胞因子种类上炙甘草汤的效果要优于强的松。

图2 各组心肌组织细胞因子水平比较

表2 各组心肌组织细胞因子水平比较

2.4 各组小鼠脾脏CD4+细胞亚群水平比较各组小鼠在给药14 d后处死，通过流式细胞术检测脾脏Th1、 Th2和Th17百分比。结果显示，与空白对照组比较，EAM组脾脏Th1、Th17水平在免疫后显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与EAM组比较，炙甘草汤组Th1及Th17水平均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。Th2水平在各组均无显著变化。而强的松组Th17水平较EAM组显著降低（P＜0.05），图3。结果提示，炙甘草汤对EAM鼠脾脏中Th1及Th17分化有明显的抑制作用，强的松仅对Th17的分化有抑制作用，但二者对Th2分化无显著影响。

图3 各组小鼠脾脏CD4+细胞亚群水平比较（与空白对照组比较，aP＜0.05；与EAM组比较，bP＜0.05）

3 讨论

根据发病的特点，中医学把心肌炎归属于“温病”范畴，根据临床表现的特点又可归属于中医学“心悸”、“怔忡”、“胸痹”等范畴。认为本病病位以心为主，涉及肺、脾、胃和肾等脏腑[11,12]。国内研究者采用中医药治疗本病，从整体观入手，以方剂为载体，取得较好效果[13,14]。我们通过构建的小鼠EAM模型，观察炙甘草汤在EAM早期阶段的作用。研究发现，在炙甘草汤组中，心肌细胞浸润程度要低于EAM组，说明EAM小鼠每日灌服炙甘草汤能改善心肌炎症反应。已有研究表明，炎症因子在心肌炎的发生发展中起着重要作用[15,16]。我们的研究发现，EAM小鼠心肌组织匀浆细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-17A、IL-1α、IL-4、IL-10、TNFα水平较对照组均有所升高。心肌炎中IFN-γ是主要的炎症细胞因子，在心肌组织中明显上调[17]。有文献指出，IL-1α和IL-1β均与柯萨奇病毒B3感染引起心肌炎过程中炎症相关基因的诱导有关[18]。而IL-17A在急性心肌炎中起次要作用，主要是促进心肌组织持续的表达IL1β、IL-6、TNF-α，在心肌炎发展为扩张型心肌病过程中的心脏重塑和心肌梗死中发挥重要作用[19]。而IFN-γ和其他细胞因子常在患者体内持续存在至感染清除后的几个月或几年。值得注意的是，在炙甘草汤组小鼠中，心肌组织匀浆中细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-1α水平均显著减少。这些细胞因子主要由炎症浸润细胞所产生，从而招募T淋巴细胞，驱动T细胞免疫应答。而心肌局部炎症细胞因子的显著增加，会影响心肌功能和心脏组织的重塑。因此，炙甘草汤治疗可能通过抑制心脏中炎症细胞因子分泌来对抗EAM，从而改善心肌炎症反应，降低心肌损伤，有利于心肌炎中心脏功能恢复。

文献表明，心肌组织中CD4+T细胞增多是自身免疫性心肌炎发生发展的重要因素，在心肌炎形成过程中，各种炎性细胞亚群渗入心脏并产生细胞因子，进一步加剧心肌炎的发展。有报道指出， Th17细胞联合Th1细胞参与了心肌炎患者的炎症反应，且协助B细胞在患者体内产生抗心肌抗体，而Th2细胞直到心肌炎晚期，才在介导体液反应中发挥重要作用。本实验通过采用重组α肌球蛋白重链多肽MyHC-α免疫小鼠，发现Th1和Th17细胞在脾脏中的比例明显升高，而应用炙甘草汤可使该模型鼠脾脏中Th1细胞和Th17细胞的比例显著下降，说明炙甘草汤可以抑制脾脏中Th1细胞和Th17细胞的活化，减少其分泌相关炎症因子，降低体内的免疫反应，一定程度上改善EAM模型心脏中炎症细胞的浸润。

综上所述，本研究表明炙甘草汤在EAM模型中可降低Th1和Th17细胞比例，抑制心肌相关细胞因子分泌，减少炎症细胞浸润。人类心肌炎与EAM模型具有相同病变特点，补充了炙甘草汤治疗心肌炎的作用位点，为用于心肌炎患者的治疗提供证据支持。