何春玫 李绿霞 覃晓

（广西农业职业技术大学，广西 南宁 530007）

在广东、广西地区，人们有将采摘的寄生枝梗或芽叶煮成凉茶饮用的习惯，其中有广西梧州的桑寄生茶曾于1992年被列为中华传统食品保健茶类。［1］桑寄生的主要有效成分是黄酮类化合物，具有较强的抗氧化活性，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿、安胎元等功效，被广泛用于中医各类处方。［2，3］桑寄生主要分布于热带和亚热带地区，朱开昕等［4］在开展广西桑寄生的分布及其寄主的调查时发现，广西桑寄生在桂南、桂东、桂中等区域分布普遍，且广西桑寄生具有广寄性，寄主植物有36个科150多种，桑寄生寄主植物和采摘部位不同，其黄酮的含量也不相同，药用功能存在差异。［5，6］

本研究以广西农业职业技术大学内桂花树寄主的桑寄生为原材料，采用超声波辅助乙醇提取桑寄生黄酮，为广西桑寄生的开发利用和文化传承提供数据参考。

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

桑寄生茶叶：采摘于广西农业职业技术大学，寄主为桂花树，阴干。

芦丁标准品（纯度≥98%，生产批号LC220726，CAS#153-18-4，合肥博美生物科技有限责任公司）；无水乙醇、氯化铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、抗坏血酸（Vc）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等，均为国产分析纯；纯化水（自制）。

1.2 仪器设备

JP-1000 B型高速多功能粉碎机（永康市久品工贸有限公司），KQ-300 DB型数控亲水性超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），EL204型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，V-1800型分光光度计［翱艺仪器（上海）有限公司］，UPT-II-20 T型优普系列超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

2 试验方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

储备液配制：精密称取芦丁标准品0．02 g于小烧杯中，加60%乙醇20～30 mL，水浴加热使其完全溶解，冷却至室温后，完全转移至100 mL容量瓶中，以60%乙醇定容，摇匀，该储备液芦丁含量为0．2 mg/mL。

标准工作液配制：精密移取上述储备液0 mL、1．0 mL、2．0 mL、3．0 mL、4．0 mL、5．0 mL、6．0 mL分别置于25 mL比色管中，各加水至6 mL，各加5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置反应6 min。各加10%AlCl3溶液1 mL，摇匀，静置反应6 min。各加4%NaOH溶液10 mL，定容至刻度线，摇匀，静置反应15 min。以芦丁空白液为参比液，在510 nm下测定各溶液的吸光度值A。以吸光度A510为纵坐标（y）、测定液芦丁的质量（x）为横坐标绘制标准曲线并拟合得到回归方程（1）。

式中，y为溶液的吸光度A510，x为溶液中总黄酮质量（mg）。

2.2 桑寄生黄酮的提取工艺和提取量的计算

2.2.1 提取工艺

将阴干的桑寄生茶叶去梗除杂质后粉碎，过60目筛，混匀后密封避光保存，备用。

精密称取一定质量桑寄生茶叶细粉于小锥形瓶中，加入一定量的一定浓度乙醇，摇匀。塞上胶塞，设置一定的时间和温度进行超声提取，过滤，取适当滤液按2．1进行显色，在510 nm下测定吸光度A510。根据回归方程（1）和公式（2）计算总黄酮质量C和总黄酮提取量。

式中，C为测定液中总黄酮质量（g），V为提取液体积（mL），n为稀释倍数，m为桑寄生茶叶细粉质量（g）。

2.2.2 稳定性实验

按2．2．1，随机选取进行三份不同提取参数的桑寄生黄酮提取液，显色后，在510 nm波长下测定60 min内的吸光度值。每隔5分钟测量一次，结果如图1所示。结果表明，在60 min内，吸光度值呈缓慢下降趋势，20 min内三个浓度溶液的吸光度均为最大值的99%以上，60 min时的吸光度占最大值的97%左右，为减少显色时间引起的误差，后续实验均在显色后20 min内完成吸光度的测定。

图1 不同工艺条件显色液稳定试验结果

2.3 单因素对桑寄生黄酮提取的影响实验

根据参考文献选择合适的影响因素进行单因素实验。［7-10］

2.3.1 超声时间的影响

选择乙醇浓度50%，液料比50∶1，提取温度60 ℃，超声功率150 W为固定参数，设置自变量超声时间为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，按2．2．1测定吸光度A510，计算黄酮提取量。

2.3.2 提取温度的影响

选择乙醇浓度50%，液料比50∶1，超声功率150 W，超声时间30 min为固定参数，设置自变量

提取温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，按2．2．1测定吸光度A510，计算黄酮提取量。

2.3.3 超声功率的影响

选择乙醇浓度50%，液料比50∶1，提取温度60 ℃，超声时间30 min 为固定参数，设置自变量超声功率为120 W、150 W、180 W、210 W、240 W，按2．2．1测定吸光度A510，计算黄酮提取量。

2.3.4 乙醇浓度的影响

选择超声功率150 W，液料比50∶1，提取温度60 ℃，超声时间30 min为固定参数，设置自变量乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%，按2．2．1测定吸光度A510，计算黄酮提取量。

2.3.5 液料比的影响

选择超声功率150 W，乙醇浓度50%，提取温度60 ℃，超声时间30 min为固定参数，设置自变量液料比为40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1，按2．2．1测定吸光度A510，计算黄酮提取量。

2.4 响应面优化实验

基于单因素对桑寄生黄酮提取的实验结果及分析，选择超声功率、超声时间、乙醇浓度等影响较显著的3个因素，并以它们为自变量，桑寄生黄酮提取量为响应值，应用Design Expert 10．0．4软件设计的Box-Behnken试验因素及水平表［11-14］见表1。

表1 Box-Behnken试验因素及水平表［11-14］

2.5 验证优化条件

按响应面优化试验方案模型拟合获得的最佳工艺条件，进行3次重复性实验，计算黄酮提取量，并将结果取平均值后，与模型给出的理论最佳数据进行比较，验证该模型的可靠性。

2.6 抗氧化性实验

以抗坏血酸作为阳性对照，拟采用桑寄生茶叶的乙醇提取物对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除试验结果来评估其体外抗氧化活性。

根据参考文献的方法［15-18］进行实验操作，精密称取0．016 g DPPH，以无水乙醇完全溶解后，于100 mL容量瓶中定容，摇匀。该DPPH溶液浓度为0．4 mmol/L。

按2．4最佳工艺提取桑寄生黄酮，测定提取量。精密移取提取滤液0．1 mL、0．2 mL、0．3 mL、0．4 mL、0．5 mL、0．6 mL、0．7 mL、0．8 mL、0．9 mL、1 mL于比色管中，分别用无水乙醇定容至10 mL，再移取稀释液2．0 mL 2份，分别加入上述 DPPH溶液2．0 mL和无水乙醇2．0 mL，混合摇匀，室温下避光反应30 min，以无水乙醇为参比液，于510 nm处分别测得吸光度A1和A2。移取 2．0 mL 蒸馏水代替样品溶液，加入上述 DPPH溶液，室温下避光反应30 min，测得吸光度值A0。根据公式（3）计算DPPH自由基清除率，并计算IC50。IC50越小，说明该物质体外抗氧化性越强。计算物质对DPPH清除率公式：

式中，A1为稀释样液加DPPH后测得的吸光度，A2为稀释样液加无水乙醇后测得的吸光度，A0为蒸馏水加DPPH后测得的吸光度。

对照试验：精密称取抗坏血酸 0．0764 g，以无水乙醇完全溶解后，定容于100 mL容量瓶中。其余操作步骤与2．6相同。根据公式（3）计算DPPH自由基清除率，并利用Excel 2019的FORECAST命令计算IC50。

3 结果与分析

3.1 单因素实验结果与分析

3.1.1 超声时间对桑寄生黄酮提取量的影响

选择乙醇浓度50%，液料比50∶1，提取温度60 ℃，超声功率150 W，考察超声时间对桑寄生黄酮提取量的影响，结果如图2所示。在超声时间10～50 min内，桑寄生黄酮的提取量为先略有起伏波动，再快速上升，当30 min时提取量达到最大值，之后提取量降低，可能在30 min内，随着超声时间的延长，桑寄生茶粉细胞在超声波的空化作用下破碎并释放能量，细胞内各种成分溶出较快，但30 min后随着超声处理时间的延长，细胞破碎程度加大，细胞的各种碎片面积增大，反而对有效成分形成表面吸附而导致检测量下降。因此设置超声时间为30 min，并选择为响应面试验因素之一。

图2 超声时间对桑寄生黄酮提取量的影响

3.1.2 提取温度对桑寄生黄酮提取量的影响

选择乙醇浓度50%，液料比50∶1，超声功率150 W，超声时间30 min，考察提取温度对桑寄生黄酮提取量的影响，结果如图3所示。温度越高，黄酮提取量也越高。随着提取温度的升高，分子的运动不断加快，植物细胞内的物质渗透到溶剂中的速度也加快，当温度达到60 ℃时，黄酮提取量达到峰值，此时提取溶剂乙醇没有出现沸腾现象，提取完成后溶剂未出现明显的挥发减少。但在实验中发现，由于高频超声波的影响，在开始实验的10 min内温度会出现±5 ℃波动，且环境温度越高波动的时间越长。当超声温度达到70 ℃时，导致提取溶剂出现沸腾现象，乙醇挥发，甚至锥形瓶很容易出现破裂的现象，因此不记录70 ℃的实验结果，后续实验设置提取温度为60 ℃，且不将提取温度作为响应面试验因素之一。

图3 提取温度对桑寄生黄酮提取量的影响

3.1.3 超声功率对桑寄生黄酮提取量的影响

选择乙醇浓度50%，液料比50∶1，提取温度60 ℃，超声时间30 min，考察超声功率对桑寄生黄酮提取量的影响，结果如图4所示。超声功率对桑寄生黄酮提取量有较大的影响，在超声功率

图4 超声功率对桑寄生黄酮提取量的影响

120～240 W范围内，黄酮提取量呈现先升后降的趋势，在超声功率为150 W时，黄酮提取量达到峰值。这是由于超声波的空化效应和搅拌作用，使桑寄生茶粉的细胞被破坏，加快了桑寄生药材中的有效成分溶解于提取溶剂中。但随着超声功率的逐渐增大，药材的粉碎程度加大，细胞内的杂质也溶解并与黄酮竞争提取溶剂，从而对黄酮的提取产生一定的影响，导致黄酮提取量下降。因此设置超声功率为150 W，并选择为响应面试验因素之一。

3.1.4 乙醇浓度对桑寄生黄酮提取量的影响

选择超声功率150 W，液料比50∶1，提取温度60 ℃，超声时间30 min，考察乙醇浓度对桑寄生黄酮提取量的影响，结果如图5所示。乙醇浓度对桑寄生黄酮提取量的影响呈现先升后降的趋势。在实验过程中发现，当乙醇浓度低于40%时，超声后过滤非常缓慢，可能是低浓度的乙醇溶液中含水量大，溶出了淀粉、蛋白质等水溶性大分子，严重影响过滤速度。50%～70%乙醇提取液的过滤速度较快，当乙醇浓度达50%时，桑寄生黄酮提取量达最大值，再增加乙醇浓度黄酮提取量反而快速下降，张心壮、胡嘉琳等［19，20］在研究桑叶的黄酮提取时也发现同样的趋势。因此设置乙醇浓度为50%，并选择为响应面试验因素之一。

图5 乙醇浓度对桑寄生黄酮提取量的影响

3.1.5 液料比对桑寄生黄酮提取量的影响

选择超声功率150 W，乙醇浓度50%，提取温度60℃，超声时间30 min，考察液料比对桑寄生黄酮提取量的影响，结果如图6所示。液料比对桑寄生黄酮提取有一定的影响，但影响很不稳定，经对数据进行单因素方差分析，P=0．38＞0．05，说明液料比对黄酮提取影响并不显著，因此从节约资源的角度考虑，后续实验设置液料比为50∶1，且不将液料比作为响应面试验因素之一。

图6 液料比对桑寄生黄酮提取量的影响

3.2 响应面实验结果与分析

Box-Behnken响应面实验设计及结果见表2。根据单因素实验结果，选择超声功率（A）、超声时间（B）以及乙醇浓度（C）为自变量，以桑寄生黄酮提取量（Y）为响应值。应用Design Expert 10．0．4软件进行Box-Behnken响应面优化试验方案设计三因素三水平实验，为减少实验误差，设计了5个中心点由软件随机分布。

表2 Box-Behnken响应面实验设计及结果

续表

经软件对表2进行数据拟合，可建立自变量A、B、C对响应值桑寄生黄酮提取量（Y）的回归方程为：

ANOVA方差分析结果如表3所示。该模型F=15．9974，P＜0．01，可判断该模型极显著。模型的失拟项P=0．9342＞0．05，拟合度R2=0．9536，校正拟合度R0dj=0．8940，变异系数%=0．95＜5，精密度值=11．27＞4，可判断该模型的拟合程度高，稳定性强，可信度较高，模型合理。因此，可应用该模型来预测和分析桑寄生黄酮的提取工艺和结果。根据各因素F值可判断对桑寄生黄酮提取量的影响大小顺序为：超声时间＞超声功率＞乙醇浓度，其中超声时间因素的影响为极显著（P＜0．01），超声功率因素的影响为显著（0．01＜P＜0．05）。

表3 ANOVA方差分析结果

3.3 各因素间交互作用分析

根据表3方差分析结果，在实验设定的因素水平下，B（超声时间）-C（乙醇浓度）间有显著的交互影响（0．01＜P＜0．05），A（超声功率）-C（乙醇浓度）间有极显著的交互影响（P＜0．01），A（超声功率）-B（超声时间）间的交互作用不显著。两两因素间交互影响的响应面图和等高线图如图7所示。各因素间交互影响的响应面图均呈伞形，说明曲面有最大响应值，但综合观察等高线图发现，超声功率-乙醇浓度、超声时间-乙醇浓度的等高线图呈椭圆形，说明它们两两因素间存在显著的交互作用，其中超声功率与乙醇浓度间形成的椭圆更狭长，说明两者间交互作用更显著，与表3方差分析的计算结果相一致。而且在各等高线图中，沿超声时间B方向的曲线更密集，说明超声时间B对桑寄生黄酮提取的影响较其他因素大。

图7 两两因素间交互影响的响应面图和等高线图

3.4 最优工艺条件验证

采用Design Expert 10．0．4软件对表3的数据进行拟合，得出提取桑寄生黄酮的最优工艺条件为超声功率143．71 W，超声时间31．96 min，乙醇浓度48．05 %，预测黄酮的提取量为49．1279 mg/g。根据实验室实际条件，将最佳工艺条件调整为超声功率150 W，超声时间32 min，乙醇浓度50 %，重复试验3次，测得黄酮提取量为49．36 ± 0．39 mg/g，与预测值相对误差为0．47%，可见该工艺条件应用于桑寄生黄酮提取是合理的。

3.5 抗氧化性实验结果与分析

桑寄生乙醇提取液DPPH自由基清除活性的结果如图8所示。以抗坏血酸为阳性对照。由图8可见，对于0．4 mmol/L DPPH溶液，在1．7～25．6 μg/ mL浓度范围内，桑寄生乙醇提取液有非常优秀的清除能力，溶液浓度越大，清除DPPH自由基的活性越强，浓度大于25．6 μg/mL后DPPH 清除活性达到最大值91．60%并基本稳定不降。与抗坏血酸对比，桑寄生乙醇提取液的DPPH自由基清除活性强于抗坏血酸，采用Excel 2019进行数据拟合，桑寄生乙醇提取液和抗坏血酸 对 DPPH 自由基清除率的回归方程分别为：y= 0．01x+ 0．7856（R2= 0．9892）、y=0．0081x+ 0．8974 （R2= 0．9992），经计算，IC50分别为6．24 μg/ mL和20．02 μg/mL，桑寄生乙醇提取液的活性是抗坏血酸的3．33倍。可见桑寄生的乙醇提取液具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂加以利用。

图8 DPPH自由基清除活性试验结果

4 结论

本研究采用桂花树桑寄生茶为研究对象，以超声波辅助乙醇提取桑寄生黄酮。在单因素实验基础上，通过响应面法设计试验优化了提取工艺，并研究了其桑寄生乙醇提取液的体外抗氧化活性。研究结果表明，各因素对桑寄生黄酮提取量的影响大小顺序为：超声时间＞超声功率＞乙醇浓度，其中超声时间的影响极显著（P＜0．01），超声功率的影响显著（0．01＜P＜0．05）。在实验设定的因素水平下，B（超声时间）-C（乙醇浓度）有显著的交互影响（0．01＜P＜0．05），A（超声功率）-C（乙醇浓度）有极显著的交互影响（P＜0．01）。经软件对数据进行拟合，桑寄生黄酮提取的最优工艺条件为超声功率143．71 W，超声时间31．96 min，乙醇浓度48．05 %，预测黄酮的提取量为49．1279 mg/g。在体外抗氧化活性试验中，桑寄生乙醇提取液对DPPH自由基有良好的清除能力，其IC50为6．24 μg/ mL，是抗坏血酸活性的3．33倍，可见桑寄生的乙醇提取液具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂加以利用。