吴晓青，赵晓燕，周方园，范素素，张广志，谢雪迎，周红姿，张新建

（齐鲁工业大学（山东省科学院）生态研究所／山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250103）

设施作物生产过程中，利用基质进行育苗已成为作物种苗生产的主要方式，育苗基质材料质地轻，保水、保肥、透气性好，是种苗工厂化生产的基础物质，优良的基质可充当“植物根系营养库”，决定了栽培植物的营养供给及生长发育状况［1］。前人研究表明，利用微生物可改善根际矿质元素有效性、调节根际次生代谢物、增强作物抗逆性等［2］；将定向筛选的具有生防促生等功能的微生物加入传统基质具有提质增产效果，是作物通过与有益微生物互作进行的主动调节。例如在基质中添加芽孢杆菌等微生物对辣椒、番茄等蔬菜作物具有壮苗效果［3］。外添微生物主要来源有商品化的生防菌及菌肥产品［4］、实验室筛选的高效生防促生菌株制剂［5］、废弃物发酵菌肥等［6］。外添微生物的选择往往仅考察功能性菌株单方面作用，忽略了植物对其定殖微生物的主动选择效应。近年来研究发现，植物表面及内部富集的微生物比宿主植物编码了更多的基因，通过协作和竞争形成稳定的群落结构，对作物抗逆及生长发育至关重要［7，8］。根际是植物与微生物互作的重要场所，植物根际微生物对于维持植物健康发挥着重要作用［9，10］，其中细菌占菌群种类的大多数。目前一种完善农业生态系统的新策略，即利用植物自身的有益微生物特征菌群，分离构建植物体的微生态稳定性，从而达到抗逆增产提质的目的［9］，受到广泛关注。为了验证在种苗基质培养中添加作物自身根际细菌的促生效应，本研究对辣椒根际高丰度细菌进行分离鉴定，筛选具有生防及促生活性的菌株，并将其回接至基质培养的同品种辣椒苗，验证根际细菌的促生作用，为研发功能性生物基质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集和处理

辣椒根系样品于2020年采自济南市设施蔬菜温室，辣椒品种为赤峰欣育（甜椒）。随机采集幼苗期、初花期和结果期各6棵辣椒植株新鲜根系，收集离地面5～15 cm的根系组织，置于50 mL灭菌Falcon离心管（BD公司，美国）中，用无菌水清洗至无肉眼可见的土壤颗粒。随后将根系转移至新的50 mL Falcon离心管，加入灭菌的1×PBS（phosphate buffered saline，pH＝7）30 mL，室温下180 r／min振荡15 min。PBS重复清洗3次。将清洗后的根系取出并置于灭菌滤纸上吸干表面PBS，切分成约2 mm小段并混合。称取1 g根系组织转移至50 mL离心管（Corning，美国），无菌环境中加入10 mL（10 mmol／L）灭菌MgCl2溶液重悬，然后用无菌捣杵研磨直至均质［11］。获得的根系均质液一部分用于16SrDNA测序分析菌群结构，一部分用于平板培养。

1.2 16SrDNA测序

对辣椒不同生长期根系均质液分别进行DNA提取，PCR扩增纯化后构建小片段文库，在Illumina NovaSeq平台（北京诺禾致源科技股份有限公司）进行双末端测序。测序原始数据经过拼接、过滤，得到有效数据。然后基于有效数据进行OTU（operational taxonomic units）聚类和物种分类分析。根据OTU聚类结果，对每个OTU的代表序列做物种注释，获得对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。对每时期的6个样本的物种丰度取并集加和，然后选取每时期在属水平上相对丰度排名前30（Top30）的菌种生成物种相对丰度柱形累加图，对各时期菌种种类比较分析形成韦恩图。

1.3 辣椒根际细菌的分离和鉴定

将各时期根系均质液混合均匀，用无菌水在无菌试管中梯度稀释为10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7和10－8，从各梯度中吸取100μL均匀涂布在TSA（trypton soy agar，Solarbio，中国）平板上，于30℃微生物培养箱内倒置培养1～3 d，观察菌落生长情况。根据菌落形态特征，将差异菌落在新TSA平板上划线获得单菌落，重复3次，根据形态特征对细菌进行分类。

用10μL移液枪头蘸取单菌落于10μL有灭菌水的96孔PCR板（Axygen，美国）中，反复吸打混匀，加入16.6μL Buffer 1（25 mmol／L NaOH＋0.2 mmol／L EDTA－Na2，pH＝12），吸打混匀，覆膜后在PCR仪（Eppendorf，德国）上95℃运行30 min。离心取上清，加入16.6μL Buffer 2（Tris－HCl，pH＝7.46），吸打混匀，获得裂解液作为模板进行PCR扩增［11］。采用细菌16S rDNA通用引物27 F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492 R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增。PCR反应体系（30μL）：裂解液3 μL，10×Taqbuffer（含Mg2＋）3μL，dNTP（100 mmol／L）2.4μL，引物27F（10μmol／L）0.3μL，引物1492R（10μmol／L）0.3μL，TaqTMHS（Takara，日本）0.15μL，ddH2O 20.85μL。PCR扩增程序：95℃5 min；94℃40 s，52℃30 s，72℃90 s，35个循环；72℃10 min。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司青岛测序部测序，测序结果在GenBank中比对并鉴定种属。使用Mega X邻接法构建系统进化树，设定Bootstrap值为500。

1.4 根际细菌的生防及促生指标检测

1.4.1 对病原菌的拮抗试验 测试用病原菌菌株为本实验室保存的9株可侵染辣椒的病原真菌，分别为藜生链格孢（Alternaria chenopodiicola）、多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）、角担菌（Ceratobasidiumsp.）、极细枝孢霉（Cladosporium tenuissimum）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、木贼镰孢菌（Fusarium equiseti）、变红镰孢 菌（F.incarna-tum）、黄色镰孢菌（F.culmorum）和轮枝镰孢菌（F.verticillioides）。

病原菌在PDA（索莱宝，中国）平板上28℃活化3次；辣椒根际细菌在TSA平板上30℃活化3次，转移至TSB（索莱宝，中国）培养液中振荡培养至OD600＝0.5待用。用5 mm打孔器打取病原菌菌落边缘菌饼，接种于9 cm PDA平板中轴线距离边缘5 mm处，在中轴线相对位置打5 mm孔并加入根际细菌菌液50μL，28℃暗培养，对照为不接种根际细菌的病原菌单独培养平板，其余条件一致。对于生长速度均衡的病原菌（灰霉菌、变红镰孢菌和角担菌），测量抑菌圈半径时间为对照病原菌菌饼沿中轴线长到平板边缘时，抑制率Ⅰ（%）＝（1－对峙病原菌半径／对照病原菌半径）×100。对于生长速度不均衡的病原菌（木贼镰孢菌、黄色镰孢菌、轮枝镰孢菌、藜生链格孢、多主棒孢霉和极细枝孢霉），在接种第3天和第6天分别测量病原菌沿中轴线的半径，并计算两次测量半径的差值。抑制率Ⅱ（%）＝（1－对峙半径差／对照半径差）×100。筛选抑制率Ⅰ≥20%（且抑菌圈半径≥1 cm）或抑制率Ⅱ≥50%的菌株，作为待测活性菌株。

1.4.2 解磷活性、铁载体和IAA活性的检测 解磷活性检测培养基参考Nautiyal［12］。NBRIP培养基（L）：葡萄糖10 g，Ca3（PO4）25 g，MgCl2·6H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO40.1 g，琼脂15 g。pH值为7.5～8.0。

铁载体活性检测培养基参考Schywn等［13］。CAS培养基（L）：CAS 60.5 mg，CTAB 72.9 mg，1 mmol／L FeCl3·6H2O 10 mL，0.1 mol／L磷酸缓冲液（NaCl 0.125 g、NH4Cl 0.25 g、NaH2PO4·2H2O0.6 g、Na2HPO4·12H2O 2.5 g、KH2PO40.08 g、H2O 1000 mL）50 mL，H2O 940 mL，琼脂15 g。pH＝6.8。

挑取根际细菌单菌落，在TSB培养液中振荡培养至OD600＝0.5，吸取10μL菌液点接至NBRIP培养基或CAS培养基上，每个菌株3次重复，30℃黑暗培养96 h，观察培养基变化。具有解磷活性的菌株应在NBRIP培养基上产生透明圈，具有铁载体的菌株应在CAS培养基上出现橙红色晕圈。

IAA活性检测：将根际细菌单菌落接种于TSB培养液中振荡培养至OD600＝0.8。取50μL菌液点接在金氏B培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）上，30℃黑暗培养96 h，取4 mL Salkowski显色剂（0.5 mol／L FeCl3与35%HClO4按体积比1∶50配制）滴加到培养基上，25℃避光反应60 min，观察菌落周围是否有粉红色晕圈。每个菌株3次重复。

1.5 辣椒根际细菌回接辣椒的基质盆栽试验

将辣椒种子用传统温汤浸种法催芽：首先将种子置于55℃水中，保持水温搅动15 min，室温浸泡6 h，分散置于装有湿滤纸的平皿上，28℃黑暗条件催芽。催芽时浸泡在1×104cfu／mL的每种待测菌悬液中作为单菌处理，将所有待测菌混合成1×105cfu／mL浓度作混菌处理（MIX），无菌水浸泡作为对照处理（CK），每处理共24个种子，平均种植于3个育苗钵内（为3个平行重复）。种子露白后，种植于商品育苗基质（湘正农科，通用型，基质成分为泥炭、脱盐椰糠、蛭石和珍珠岩，有机质22.21%，pH值为5.5～7.0，出厂前灭菌处理）。不施任何肥料，在26℃、长日照条件下正常管理2周后，回接组每钵再补接1×106cfu／mL单株或混合菌液3 mL，对照组无菌水处理。待大部分植株展开4片真叶时进行取样统计。测量每株最大叶片的叶长和叶宽；将整苗脱离育苗钵并小心洗脱根系外附着物，立即铺平用扫描仪扫描成像，用Image J 1.51软件测量扫描图片中的根长；吸干植株表面水分后，分别称量根系和地上部重量。

1.6 数据统计与分析

采用Microsoft Excel进行数据处理。利用SPSS 21.0软件进行差异显著性分析（P＜0.05）；SigmaPlot 12.5制作柱状图；BioEdit软件绘制系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 辣椒根际细菌的菌群分析及特征群落的分离鉴定

通过16S rDNA测序分析，根据物种注释结果（取条带数大于等于5），辣椒幼苗期根际细菌有171个属、初花期有199个属、结果期有156个属。辣椒3个生长时期属水平上丰度Top30的菌群结构和丰度有差异。幼苗期丰度最高的3个属为黄杆菌属（Flavobacterium）、链霉菌属（Streptomyces）和纤维弧菌属（Cellvibrio）；初花期为根瘤菌属（Rhizobium）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属；结果期为泛菌属（Pantoea）、假单胞菌属和食酸菌属（Acidovorax）（图1A）。在相对丰度Top30的属中，3个时期均出现的属有14个（图1B），分别为黄杆菌属、链霉菌属、纤维弧菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、列契瓦尼尔氏菌属（Lechevalieria）、Roseateles、德沃斯氏菌属（Devosia）、食酸菌属、Tahibacter、鞘脂菌属（Sphingobium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和气单胞菌属（Aeromonas），将该14个属作为辣椒品种的特征群落。

在辣椒整个生长期，利用TSA培养基分离获得的辣椒根际细菌共102株，经形态和16SrDNA测序鉴定属于15属102个种。与16SrDNA测序结果比对可知，分离得到的细菌中属于高通量分析中辣椒特征群落的有7个属共82株菌（图1C），包括食酸菌属（1株）、芽孢杆菌属（45株）、黄杆菌属（5株）、假单胞菌属（17株）、类芽孢杆菌属（2株）、根瘤菌属（10株）和链霉菌属（2株）。将上述分离得到的82株根际细菌进行活性分析。其余分离得到的菌株包括布哈加瓦氏菌（Bhargavaea）、成对杆菌属（Dyadobacter）、假芽孢杆菌（Fictibacillus）、赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus）、森林土源芽孢杆菌（Solibacillus）、微杆菌属（Microbacterium）、申氏菌（Shinella）和寡养单胞菌（Stenotrophomonas）共8个属20株细菌，其丰度均未达到各时期的Top30，本研究后续不采用。

图1 辣椒根际细菌的16SrDNA测序分析和分离结果

2.2 辣椒根际拮抗病原菌及促生活性的筛选

对分离获得的82株根际细菌进行平板抑菌试验，获得病原菌藜生链格孢的拮抗菌［副地衣芽孢杆菌（B.paralicheniformis）W17等］21株；病原菌灰霉菌的拮抗菌［多粘类芽孢杆菌（P.polymyxa）W33、贝 莱 斯芽 孢杆菌（B.velezensis）W19－2等］17株；病原菌多主棒孢霉的拮抗菌［多粘类芽孢杆菌W33、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）W3－B9等］18株；病原菌角担菌的拮抗菌［枯草芽孢杆菌W3－B9等］10株；病原菌极细枝孢霉的拮抗菌［枯草芽孢杆菌W3－B9、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）W2－1等］25株；病原菌木贼镰孢菌的拮抗菌（解淀粉芽孢杆菌W3－F9、多粘类芽孢杆菌W33等）27株；病原菌变红镰孢菌的拮抗菌（多粘类芽孢杆菌W33、枯草芽孢杆菌W3－B9等）18株；病原菌黄色镰孢菌的拮抗菌（多粘类芽孢杆菌W33、枯草芽孢杆菌W3－B9等）24株；病原菌轮枝镰孢菌的拮抗菌［解淀粉芽孢杆菌W2－1、普沙根瘤菌（R.pusense）W4－C11等］36株。抑菌谱较广的拮抗菌有9株，其中多粘类芽孢杆菌W33、解淀粉芽孢杆菌W3－C2、解淀粉芽孢杆菌W2－1和贝莱斯芽孢杆菌W19－2可拮抗9种病原菌，解淀粉芽孢杆菌W2－2、枯草芽孢杆菌W3－B9、枯草芽孢杆菌W3－F8、解淀粉芽孢杆菌W3－F9、普沙根瘤菌W4－C11可拮抗8种病原菌。

对分离获得的82株根际细菌进行铁载体活性、解磷能力和IAA活性检测，结果表明，能溶解Ca3（PO4）2的菌株共31株，其中阿氏芽孢杆菌（B.aryabhattai）W3，香茅醇假单胞菌（Ps.citronellolis）W31－1、W31－2，铜绿假单胞菌（Ps.aeruginosa）W34，Ps.mendocinaW35、假单胞菌W36－1、W36－5、W36－6，普沙根瘤菌W37－1、W37－2和根瘤菌W38－1产生的透明圈径（透明圈半径减去菌落半径）＞1.5 cm。具有铁载体活性的菌株共15株，包括假单胞菌W36－1、W36－2、W36－3、W36－4、W36－5、W36－6、W36－7，阿氏芽孢杆菌W3，香茅醇假单胞菌W31－1、W31－2，铜绿假单胞菌W34，Ps.mendocinaW35，根瘤菌W38－2和链霉菌W42－1、W42－2。具有IAA活性的菌株共9株，包括多粘类芽孢杆菌W33，解淀粉芽孢杆菌W3－B9、W3－C2，枯草芽孢杆菌W3－B9，阿氏芽孢杆菌W3，普沙根瘤菌W37－1、W37－2和根瘤菌W38－1、W38－2。

综合上述生防及促生活性检测结果，以同时兼具抑菌和促生活性为标准，最终选择多粘类芽孢杆菌W33，普沙根瘤菌W37－1、W37－2，根瘤菌W38－1、W38－2，香茅醇假单胞菌W31－1、W31－2，贝莱斯芽孢杆菌W19－2，阿氏芽孢杆菌W3，Ps.mendocinaW35，假单胞菌W36－6，枯草芽孢杆菌W3－B9，解淀粉芽孢杆菌W3－C2、W3－F9、W2－1共15株细菌进行促生作用盆栽试验（图2）。

图2 从辣椒根际筛选的15株细菌的防病促生活性特征图

2.3 根际细菌回接辣椒的盆栽试验

结果（图3A、B）表明，根际细菌对辣椒地上部及根鲜重均有提高作用，其中多粘类芽孢杆菌W33对地上部和根鲜重均有显著提高作用（P＜0.05），地上部鲜重较对照提高48.52%，根鲜重提高151.61%。另外，普沙根瘤菌W37－1和W37－2、根瘤菌W38－1和W38－2、解淀粉芽孢杆菌W3－C2、阿氏芽孢杆菌W3、枯草芽孢杆菌W3－B9、香茅醇假单胞菌W31－2只显著提高了根鲜重（P＜0.05），较对照分别提 高73.19%、126.12%、93.69%、89.32%、109.29%、95.63%、76.10%和75.54%。混合菌可显著提高地上部和根鲜重（P＜0.05），较对照分别提高40.52%、125.95%。根冠比反映了根系与地上部关系，一般认为，根冠比越高，植株生长越好。由图3C可知，根际细菌W38－2、W3－C2、W37－2和W33对根冠比有显著改善作用（P＜0.05），较对照分别提高98.05%、93.78%、86.35%和68.74%；混合菌显著提高根冠比60.74%。

对根长和叶片大小（叶长×叶宽）进行测量，结果（图3D、E）表明，除了W35和W31－1与对照无显著差异，其余根际细菌都显著增加了根长（P＜0.05），增幅为22.85%～43.95%。混合菌也可显著促进根长（P＜0.05），增幅为35.79%。与对照相比，根际细菌W36－6和混合菌对叶片大小增加作用明显，而W3－C2、W3－B9、W31－1和W35等菌株抑制叶片生长，但所有菌株的作用均不显著（P＜0.05）。

综上，15株根际细菌对辣椒生长均有不同程度的促进作用，其中多粘类芽孢杆菌W33的增重效果最显著，还可显著促进根的生长，对根冠比也有显著的调节作用。而菌株混合接种不仅具有显著的增重、调节根冠比、促根生长的效果，还在一定程度上增加了叶面积（图3F），在各促生指标上都表现突出。

图3 15株辣椒根际细菌及混合菌回接辣椒对其生长的影响

3 讨论与结论

本研究分析了辣椒幼苗期、初花期和结果期的根际细菌群落结构，3个生长期的相对丰度均在Top30的属有14个，分别为黄杆菌属、链霉菌属、纤维弧菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、列契瓦尼尔氏菌属、Roseateles、德沃斯氏菌属、食酸菌属、Tahibacter、鞘脂菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属和气单胞菌属。其中7个属可通过TSA培养获得，包括食酸菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属、假单胞菌属、类芽孢杆菌属、根瘤菌属和链霉菌属。除了食酸菌属通常为植物病原菌以外［14］，其它多为具有植物促生潜力的菌属。例如，芽孢杆菌属中的解淀粉芽孢杆菌［15］等、黄杆菌属中的黄杆菌［16］、假单胞菌属中的Ps.plecoglossicida［17］等、根瘤菌属中的普沙根瘤菌［18］等和链霉菌属中的变异链霉菌（S.variabilis）［19］等均被报道为植物根际促生菌（PGPR）。

对分离的属于辣椒特征群落7个属的82株细菌进行抑菌及促生试验。抑菌性测定选用可侵染辣椒的9种真菌病原菌，其中藜生链格孢可引起辣椒黑斑病［20］，多主棒孢霉引起辣椒棒孢叶斑病［21］，角担菌引起丝核菌病害［22］，极细枝孢霉引起枝孢菌病害［23］，灰霉菌引起灰霉病［24］，木贼镰孢菌、变红镰孢菌、黄色镰孢菌和轮枝镰孢菌引起辣椒腐烂病。辣椒根际细菌中，多粘类芽孢杆菌W33、解淀粉芽孢杆菌W3－C2、解淀粉芽孢杆菌W2－1和贝莱斯芽孢杆菌W19－2对上述9种病原菌均有抑制作用。其中多粘类芽孢杆菌对多主棒孢霉、角担菌、极细枝孢霉和木贼镰孢的抑菌性，解淀粉芽孢杆菌对多主棒孢霉、角担菌、极细枝孢霉、木贼镰孢菌、变红镰孢菌和黄色镰孢菌的抑菌性和贝莱斯芽孢杆菌对多主棒孢霉、角担菌、极细枝孢霉、木贼镰孢菌和变红镰孢菌的抑菌性鲜有报道。对82株细菌的解磷、铁载体和IAA活性的测定结果表明，同时具有3种促生活性的菌株为阿氏芽孢杆菌W3，另外解淀粉芽孢杆菌W3－C2和W3－F9、普沙根瘤菌W37－1和W37－2、根瘤菌W38－1同时具有解磷和IAA活性；Ps.mendocinaW35、香茅醇假单胞菌W31－1和W31－2、假单胞菌W36－6同时具有铁载体和解磷活性；根瘤菌W38－2同时具有铁载体和IAA活性。

基质盆栽试验中，除了假单胞菌属的菌株Ps.mendocinaW35和香茅醇假单胞菌W31－1对辣椒根长影响不显著，其它菌株均有显著的促进作用。大部分根际细菌对地上部分的促生效果不显著，仅多粘类芽孢杆菌W33显著增加了地上部鲜重；所有菌株对叶片大小的影响未达显著水平；根瘤菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属都有菌株显著增加根冠比，而假单胞菌属的菌株对根冠比无显著影响。本研究中对辣椒具有较好促生作用的菌株有多粘类芽孢杆菌W33和解淀粉芽孢杆菌W3－C2等。张杨等［25］从‘苏椒5号’中筛选的高产IAA和ACC脱氨酶的枯草芽孢杆菌NJAU－G10可显著促进基质栽培辣椒的生长。推测在促生作用上，具有IAA活性是重要的指标。另外，混合菌接种的促生效果整体优于单菌接种，但在实际应用中多菌株发酵的难度显然高于单菌株发酵，下一步需进行发酵条件的优化。本研究验证了辣椒根际细菌对基质栽培辣椒的促生作用，为研发功能性生物基质奠定了基础。