陈志迪，张思宁，夏 凡，钟连全，易欣欣，高秀芝*

(1.北京农学院食品科学与工程学院/食品质量与安全北京实验室/农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206；2.北京市昌平区种子管理站，北京 102200)

植物多酚是一种小分子天然有机化合物，由植物生长发育代谢活动而产生，广泛存在于植物的表皮、根系、叶和果实中[1]。植物多酚属于芳香族羟基化合物，根据结构不同分为两大类：一类是类黄酮，包括黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类等；另一类是非类黄酮，包括芪类、单宁、酚酸类等[2]。多酚具有抑菌[3]、预防糖尿病和心血管疾病[4-5]、促进抗癌细胞增殖[6]等生物活性。以植物多酚为原料的天然防腐剂因其性能高效、安全性好，且具有一定营养价值，广泛用于食品工业领域[7]。

生菜(LactucasativaL.)又名叶用莴苣、鹅子菜、麦子菜、莴籽菜，为一年生或二年生草本植物[8]。食用方法多样，因其口感清脆、营养物质含量丰富，作为生食蔬菜广受大众欢迎[9]。生菜起源于欧洲，从东南沿海地区引进至中国[10]。PEPE等[11]研究表明，莴苣中含有羟基肉桂酸、邻氧萘酮、黄烷醇等16种多酚类化合物，具有良好的抗氧化和抗炎活性。MARTíNEZ-SáNCHEZ等[12]研究发现绿叶莴苣主要含酚酸类物质，紫叶莴苣中含丰富的黄酮醇。

多酚的提取方法主要有溶剂浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等[13]。超声辅助提取法操作过程简单，成本低廉，是目前应用最为广泛的一种多酚提取方法。王佰灵等[14]利用Box-Behnken响应面法对景天三七总多酚的超声辅助提取工艺进行优化，优化因素包括液料比、乙醇体积分数、超声时间、超声温度。

该试验拟采用超声辅助提取法，利用单因素结合正交试验的方法研究乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声温度4个因素对散叶生菜中的多酚提取量的影响，优化散叶生菜多酚的提取工艺，确定散叶生菜多酚提取的最佳工艺条件，比较5种散叶生菜多酚的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料散叶生菜，其中提取条件优化所用散叶生菜购自北京农学院超市；北散生1号、北散生2号、北紫生1号、北紫生2号、北紫生3号来自昌平农作物试验展示基地；没食子酸标准品(纯度≥98%)：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇，分析纯：北京东方博远科技发展有限公司。

真空冷冻干燥机(CHRIST冻干机有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 提取工艺 新鲜散叶生菜叶片30 g，真空冷冻干燥24 h，粉碎后过250 μm筛，超声辅助乙醇浸提，8 000 r/min离心15 min，得到多酚粗提液。

1.2.2 多酚含量的测定 散叶生菜中多酚含量的测定采用福林酚法[15]，按公式1计算多酚含量mg/kg(以没食子酸计)，X为散叶生菜中多酚含量，mg/kg；C为标准曲线多酚质量浓度，mg/mL；V1为稀释体积，mL；V2为乙醇溶液体积，mL；V3为量取的多酚粗提液体积，mL；M为散叶生菜鲜重，g。

X=(C×V1×V2)/(M×V3)×1 000

(公式1)

1.2.3 标准曲线绘制 根据康超等[16]的研究方法略作修改，在OD765 nm下测量吸光度。纵坐标为吸光度，横坐标为没食子酸质量浓度，绘制标准曲线。

1.3 散叶生菜中多酚提取工艺

1.3.1 单因素试验 在料液比1∶30，超声温度50 ℃，超声时间60 min，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、75%和80%的条件下提取散叶生菜多酚，在OD765 nm下测定吸光度并计算多酚含量。

在乙醇体积分数70%，超声温度50 ℃，超声时间60 min，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，提取散叶生菜多酚，在OD765 nm下测定吸光度并计算多酚含量。

在乙醇体积分数70%，料液比1∶30，超声温度50 ℃，超声时间分别为30、45、60、90和120 min的条件下提取散叶生菜多酚，在OD765 nm下测定吸光度并计算多酚含量。

在乙醇体积分数70%，料液比1∶30，超声时间60 min，超声温度分别为30、40、45、50和60 ℃的条件下提取散叶生菜多酚，在OD765 nm下测定吸光度并计算多酚含量。

1.3.2 正交试验设计 选择乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声温度作为4个因素，每个因素分别选取3个水平，进行L9(34)四因素三水平正交试验，以确定散叶生菜中多酚的最优提取条件。以正交表中最佳组合为优化组、正交试验各因素最佳水平组为对照组，对最优条件组合进行验证。

表1 试验因素水平表Tab.1 Level of experimental factors

1.4 数据统计分析

每个试验都有3组平行，并将得到的数据取平均值。使用Excel软件进行单因素试验和正交试验的数据分析并绘图，数据统计分析选用Excel-2016和SPSS19.0，差异显著性为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线

根据没食子酸的质量浓度与吸光度，得到标准曲线如图1。标准曲线的回归方程Y= 25.831X-0.0005，其中Y为吸光度，X为没食子酸质量浓度(mg/mL)，线性回归系数R2= 0.9992。

图1 没食子酸标准曲线Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对散叶生菜多酚提取量的影响 当乙醇体积分数70%时散叶生菜多酚的提取量达到最大值，为522.16 mg/kg(图2)。出现这种情况可能由于多酚的结构中带有羟基具有一定极性，乙醇与多酚的极性越接近，各物质之间的化学键越容易被破坏，则多酚提取量越高[17]。乙醇体积分数选取60%～75%这个区间继续后续正交试验。

图2 乙醇体积分数对散叶生菜多酚提取量的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.2.2 料液比对散叶生菜多酚提取量的影响 料液比对散叶生菜多酚提取量的影响如图3所示。在料液比1∶15时散叶生菜中多酚提取量达到最大值，之后随料液比的增大，散叶生菜多酚提取量下降。可能是由于在1∶15时多酚的溶解达到饱和，继续增大料液比增大其他杂质的溶出率，从而导致多酚提取量降低[18]。选取1∶10～1∶20这个区间的料液比进行后续正交试验。

图3 料液比对散叶生菜多酚提取量的影响Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols from leaf lettuce

2.2.3 超声时间对散叶生菜多酚提取量的影响 当超声时间60 min时，散叶生菜中的多酚提取量达到最大值。随着超声时间的增大散叶生菜多酚提取量反而减少(图4)。如果超声时间太短，则多酚将无法充分溶解，提取率会偏低，如果超声时间太长，会使提取温度升高导致多酚受热氧化分解，而且随着提取温度升高，细胞通透性增大，其他物质的溶出也会影响提取率[19]。超声时间选取45～90 min这个区间进行正交试验。

图4 超声时间对散叶生菜多酚提取量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.2.4 超声温度对散叶生菜多酚提取量的影响 随着超声温度的增加，散叶生菜多酚提取量先略有下降后上升至顶峰最后又下降(图5)。在50 ℃时多酚提取量最高。超声温度的升高促进多酚的溶解，但如果超声温度过高，则散叶生菜的多酚会热分解，破坏已提取出多酚的结构，使多酚得率降低[20]。后续正交试验选择45～60 ℃这个范围内的超声温度。

图5 超声温度对散叶生菜多酚提取量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.3 正交试验

表2为正交试验结果。根据R值大小可以看出各因素对散叶生菜多酚提取量的影响大小顺序为：乙醇体积分数>超声温度>超声时间>料液比；正交试验得出最优工艺组合为乙醇体积分数75%、料液比1∶20、超声时间60 min、超声温度60 ℃。

方差分析见表3。乙醇体积分数F值6.461，料液比F值0.194，超声时间F值1.519，超声温度F值3.940。从而可知，乙醇体积分数对散叶生菜多酚提取效果具有极显著性影响(P<0.01)，超声温度对散叶生菜多酚提取效果具有显著影响(P<0.05)，而料液比和超声时间对散叶生菜多酚提取效果的影响不显著(P>0.05)。

表2 散叶生菜多酚提取正交试验结果表(L934)Tab.2 Orthogonal test results (L934) of leaf lettuce polyphenols

乙醇体积分数对散叶生菜多酚提取效果具有极显著性影响(P<0.01)，可选择75%；超声温度对散叶生菜多酚提取效果具有显著影响(P<0.05)，可选择60 ℃；而料液比和超声时间均对散叶生菜多酚提取效果的影响不显著(P>0.05)，且根据k值的大小发现料液比1∶10与1∶20的均值相差不大，故从成本方面考虑，可选最佳料液比为1∶10，而超声时间60 min值最大，故超声时间60 min为最佳可取值。

超声提取工艺的最优条件为乙醇体积分数75%、料液比1∶10、超声时间60 min、超声温度60 ℃，这是理论上超声提取散叶生菜多酚的最佳工艺条件。

表3 正交试验结果方差分析表Tab.3 Orthogonal experiment results analysis of variance table

2.4 验证试验

验证试验结果见表4。多酚提取量分别为(1 233.5±49.7)mg/kg、(1 152.6±25.5)mg/kg和(1 128±12.53)mg/kg，超声提取散叶生菜多酚的最佳工艺条件为乙醇体积分数75%、料液比1∶10、超声时间60 min、超声温度60 ℃。

表4 散叶生菜多酚提取工艺验证试验结果表Tab.4 Validation test result table of polyphenol extraction technology from leaf lettuce

2.5 不同品种散叶生菜多酚含量

选用最佳提取工艺对5种散叶生菜的多酚进行提取，测定含量见图6。不同品种散叶生菜之间多酚含量存在差异，其中北紫生1号多酚含量显著高于其他品种(P<0.05)，含量为(1 176±48.5) mg/kg；北散生2号的含量最低为(622.3±65.2) mg/kg。

注：ab表示差异显著(P<0.05)。Note:ab means significant difference (P<0.05).图6 不同品种散叶生菜多酚含量Fig.6 Contents of polyphenols in different varieties of leaf lettuce

3 讨 论

该试验通过单因素结合正交试验的方法优化散叶生菜多酚超声辅助提取的最佳工艺，多酚可以溶于水和醇类、醚类、酮类等有机溶剂[21]，常用的有机溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮等，乙醇毒性小、回收率高，所以该试验选用乙醇作为提取溶剂。杨文娟等[22]对花生多酚的超声辅助提取工艺进行优化，各因素对提取量的影响大小顺序为乙醇体积分数、超声温度、料液比、超声时间。在该试验中，4种因素对散叶生菜多酚提取量的影响程度与杨文娟等[22]研究结果大致相同，乙醇体积分数影响是最大的，其次是超声温度，虽然超声时间和料液比的结果不一致，但是这两种因素影响较小。用最优提取工艺提取5种不同的散叶生菜多酚，不同品种散叶生菜多酚含量存在差异，杨晓等[23]在研究中发现不同品种生菜酚类物质含量存在差异，即使相同品种，由于光照和采收时间不同，总酚含量也有差异。

该试验通过单因素和正交试验探究乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声温度对散叶生菜中多酚提取量的影响，各因素的影响顺序为乙醇体积分数>超声温度>超声时间>料液比；最佳提取工艺为乙醇体积分数75%、料液比1∶10、超声时间60 min、超声温度60 ℃；北紫生1号的多酚含量显著高于其他品种，为(1 176±48.5)mg/kg。