边海涛

张雨萌2

勇艳华1

李 鹏1

王立娜1

苏春敏1

(1. 大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁 大连 116630；2. 沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016)

GB 16740—2014《食品安全国家标准 保健食品》中明确指出保健食品不以治疗疾病为目的，并且不得对人体产生任何危害。然而，一些不法分子为了牟取经济利益，宣称所生产的保健食品具有治疗疾病的功效，并通过非法添加化学药物来达到所谓的疗效，对消费者构成极大的健康威胁。辅助降血糖类保健食品是最为畅销的保健食品种类之一，其非法添加成分包括磺脲类胰岛素促泌剂(醋磺己脲、格列本脲、格列美脲、格列喹酮)[1-2]、双胍类(二甲双胍、苯乙双胍、丁二胍)[3-5]、α-葡萄糖苷酶抑制剂(阿卡波糖、伏格列波糖)[4]、胰岛素增敏剂(罗格列酮、吡格列酮)[6-7]、二肽基肽酶-4抑制剂(维格列汀)[8]等多种类型降血糖类药物。恩格列净属于钠—葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂，利格列汀、沙格列汀和阿格列汀属于二肽基肽酶-4抑制剂，用于治疗2型糖尿病，且均已在中国上市，存在被不法分子非法添加到保健食品中的风险。

目前，保健食品中降血糖类药物的检测方法有薄层色谱法[9]、红外光谱法[10]、质谱法[11]、拉曼光谱法[12-13]、高效液相色谱法[6-7,14-15]、液相色谱—串联质谱法[1-2,4,16-19]、高效液相色谱—高分辨质谱法[20]等。液相色谱—串联质谱联用技术具有灵敏度高、特异性强、可以通过二级质谱分析对结构进行确证的特点，是近年来保健食品中降血糖类药物检测方面的主流方法，也被广泛应用于血浆、尿液等生物样品中恩格列净、利格列汀、沙格列汀、阿格列汀的测定[21-24]，但其在保健食品中上述4种降血糖类药物检测方面的研究尚未见报道。研究拟采用甲醇提取保健食品中的目标物，高效液相色谱—串联质谱仪进行定性和定量分析，建立一种简便、快速、准确同时检测保健食品中恩格列净、利格列汀、沙格列汀和阿格列汀的方法，以期为保健食品中4种降血糖类药物的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱—串联质谱仪：1290 Infinity-6490型，美国Agilent公司；

电子天平：BSA224S型，德国Sartorius公司；

高速离心机：CR22GⅡ型，日本HITACHI公司；

数控超声波清洗器：SK7200G型，上海科导超声仪器有限公司；

漩涡混合器：XW-80A型，上海精科实业有限公司；

超纯水系统：arium®pro型，德国Sartorus公司；

甲醇：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

乙腈：色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司；

甲酸：色谱纯，美国MREDA公司；

试验用水为超纯水(电导率18.2 MΩ)；

口服液、片剂、胶囊样品：市售；

恩格列净(CAS：864070-44-0)、利格列汀(CAS：668270-12-0)、沙格列汀(CAS：361442-04-8)、阿格列汀(CAS：850649-61-5)标准物质：纯度均>95%，加拿大Toronto Research Chemicals公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 准确称取1 g(精确至0.001 g)样品于100 mL离心管中，加入甲醇45 mL，涡旋混匀，超声提取30 min，12 000 r/min离心3 min，取上清液转移至50 mL 容量瓶中，冷却，加甲醇定容，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤后备用。

1.2.2 标准溶液配制

(1) 标准溶液：分别准确称取适量恩格列净、利格列汀、沙格列汀、阿格列汀标准品，用甲醇定容，配制成标准储备溶液。分别准确移取适量标准储备溶液，甲醇定容，配制成质量浓度为10 mg/L的恩格列净、利格列汀混合标准溶液和质量浓度为1 mg/L的沙格列汀、阿格列汀混合标准溶液。

(2) 基质匹配混合标准工作溶液：分别准确移取恩格列净、利格列汀混合标准溶液20，40，80，150，300，500 μL，沙格列汀、阿格列汀混合标准溶液20，40，100，300，500，1 000 μL于10 mL容量瓶中，用空白样品前处理后的样品溶液定容，作为系列基质匹配混合标准工作溶液。

1.2.3 色谱和质谱条件

(1) 液相色谱条件：色谱柱为Agilent SB-Aq色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温25 ℃；流速0.2 mL/min；进样量1 μL；流动相为0.1%甲酸—水溶液(A)和0.1%甲酸—乙腈溶液(B)；梯度洗脱程序：0.0～6.5 min，2%～60% B；6.5～6.6 min，60%～90% B；6.6～7.6 min，90% B；7.6～7.7 min，90%～2% B；7.7～10.0 min，2% B。

(2) 质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式ESI+；干燥气流量15 L/min，干燥气温度300 ℃；雾化气压力2.41×105Pa；鞘气流量11 L/min，鞘气温度350 ℃；毛细管电压4 000 V；多反应监测(MRM)。

1.2.4 基质效应 采用提取后加入法，按式(1)对基质效应(ME)进行评价。ME>0为基质增强效应，ME<0为基质抑制效应。

ME=(A-B)/B×100%，

(1)

式中：

A——空白基质提取液中定量加入4种降血糖药物后测定的峰面积；

B——相同浓度的标准溶液测定的峰面积。

1.2.5 线性范围测定 测定不同浓度基质匹配混合标准工作溶液，以4种降血糖药物浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制基质匹配标准曲线。

1.2.6 定量限及检出限测定 向口服液、片剂、胶囊等空白基质中添加一定浓度的4种降血糖药物，以10倍信噪比(S/N=10)时对应的目标物浓度计算得到定量限，以3倍信噪比(S/N=3)计算得到检出限。

1.2.7 回收率和精密度测定 向口服液、片剂、胶囊等空白基质中定量添加4种降血糖药物的标准溶液，按建立的方法进行测定并计算方法回收率。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件确定

保健食品中降糖类药物多采用甲醇[2,4]、甲醇—水[15]、乙腈[25]进行提取。恩格列净、利格列汀、沙格列汀、阿格列汀在甲醇中均有良好的溶解性。试验结果表明：采用甲醇超声提取，4种降血糖药物的回收率为83.1%～105.6%，可以满足保健食品中4种降血糖药物的提取要求。

2.2 色谱条件优化

试验结果表明，以水—乙腈作为流动相，沙格列汀和阿格列汀的峰形较差，加入0.1%甲酸可以显著改善沙格列汀和阿格列汀的峰形，加入0.2%甲酸的改善效果与0.1%甲酸的无明显差别，因此选择0.1%甲酸—水溶液和0.1% 甲酸—乙腈溶液作为流动相。由图1可知，4种降血糖药物可以获得较好的峰形、分离度和灵敏度。

图1 标准溶液的总离子流色谱图和多反应监测色谱图Figure 1 TIC and MRM chromatograms ofstandard solution

2.3 质谱条件优化

4种降血糖药物均在正离子模式下响应更高，母离子、定量及定性离子和碰撞能量等质谱参数优化结果见表1，该条件下4种降血糖药物可达到最佳的检测灵敏度。

表1 4种降血糖药物的质谱分析参考参数†Table 1 MS/MS parameters of 4 anti-diabetic medicines

2.4 基质效应

由图2可知，不同基质对4种降血糖药物的质谱响应有不同的效应，口服液中4种降血糖药物为8%～21%的增强效应；片剂中3种降血糖药物为3%～41%的抑制效应，而利格列汀为70%的增强效应；胶囊中3种降血糖药物为28%～104%的增强效应，而恩格列净为37%的抑制效应。因此，采用基质匹配标准曲线对4种降血糖药物进行定量，以降低基质效应的影响[26]。

图2 4种降血糖药物的基质效应Figure 2 Matrix effects of 4 anti-diabetic medicines

2.5 线性范围、检出限与定量限

由表2可知，沙格列汀和阿格列汀在2～100 μg/L内线性关系良好，恩格列净和利格列汀在20～500 μg/L内线性关系良好，R2>0.99；沙格列汀、阿格列汀的检出限为0.03 mg/kg，定量限为0.10 mg/kg；恩格列净、利格列汀的检出限为0.30 mg/kg，定量限为1.00 mg/kg。

表2 4种降血糖药物的线性范围、R2、检出限和定量限Table 2 Linear ranges, R2, detection limits and quantification limits of 4 anti-diabetic medicines

2.6 回收率和精密度

由表3可知，4种降血糖药物的回收率为77.5%～113.0%，相对标准偏差为0.9%～9.4%，表明方法的准确度与精密度良好。

表3 4种降血糖药物的回收率和相对标准偏差Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 4 anti-diabetic medicines (n=6)

2.7 实际样品测定

采用试验建立的方法对市售的15种降糖类保健食品进行了分析测定，均未检出恩格列净、利格列汀、沙格列汀和阿格列汀。

3 结论

采用甲醇超声提取，高效液相色谱—串联质谱法测定，基质匹配标准曲线外标法定量，建立了同时快速检测保健食品中恩格列净、利格列汀、沙格列汀和阿格列汀4种降血糖类药物的方法。结果表明，4种降血糖药物的回收率为77.5%～113.0%，相对标准偏差小于10%，沙格列汀、阿格列汀的检出限和定量限分别为0.03，0.10 mg/kg，恩格列净、利格列汀的检出限和定量限分别为0.30，1.00 mg/kg。该方法快速、简便、灵敏，结果准确可靠，适用于口服液、片剂、胶囊等保健食品中4种降血糖药物的确证与定量测定。后继将完善保健茶等基质中4种降血糖药物的检测方法。