徐叶　姜霁珊　黄志雄　郭铁兰　 孙奥　秦智

摘  要： 利用间歇实验对产氢菌XY-18和产氢菌XY-72进行了产氢性能相关实验，比较了两者的产气量、产氢量、细胞干重、pH值和葡萄糖利用率等指标.研究结果表明：在温度为20 ℃的条件下，产氢菌XY-18累计产气量为4 333 mL∙L，累计产氢量为3 946 mL∙L，细胞干重为1.53 g∙L，最佳产氢pH值范围为4.5～4.9，葡萄糖利用率为96%. 结合对产氢量、细胞干重量和pH值等参数的综合分析发现，产氢菌XY-18是一株能够在低温条件下具有较好产氢能力的厌氧产氢菌.

关键词： 生物制氢; 低温产氢; 间歇实验; 产氢性能

中图分类号：  Q 939.9       文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2022）01-0064-06

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In this paper， the hydrogen-producing bacteria XY-18 and hydrogen-producing bacteria XY-72 were used to carry out hydrogen-producing experiments at the temperature of 20 ℃. The gas production， hydrogen production， cell dry weight， pH and glucose utilization rate of both were detected. The results showed that the total gas production of XY-18 was 4 333 mL∙L， the total hydrogen production was 3 946 mL∙L， the cell dry weight was 1.53 g∙L， the optimal pH range was 4.5-4.9， and the glucose utilization rate was 96% at the temperature of 20 ℃. Combined comprehensive analysis of parameters including hydrogen production， cell dry weight and pH value showed that hydrogen-producing bacteria XY-18 is a low-temperature anaerobic hydrogen-producing bacteria that can produce hydrogen under at low temperature.

biological hydrogen production; low-temperature hydrogen production; batch experiment; hydrogen production performance

0  引 言

氢气是一种理想的清洁能源，氢气的有效利用是解决能源短缺问题的方案之一.厌氧发酵微生物制氢技术可以有效地利用藻类生物质、纤维素、葡萄糖、淀粉等多种原料，与化学和物理方法相比，具有成本低、易于实施、制氢速度较快等优点.厌氧发酵微生物制氢法通过生物转化进行生物制氢，是一种可用于工业化生产的制氢技术，近几年成为最有效的制氢方法之一.

温度是影响厌氧发酵微生物制氢速率的重要因素.根据不同厌氧菌的最适生长温度，可将其分为超高温产氢菌、嗜热产氢菌、中温产氢菌、低温产氢菌等.目前，国内外研究主要关注了高温、中温对厌氧产氢菌产氢性能的影响.1） 高温产氢菌的产氢温度范围一般在40～65 ℃.例如，戊糖发酵产氢菌W16在温度为55～60 ℃时具有较好的生长和产氢效果，并在温度为60 ℃时，产氢量达到最大值2.0 mol H（每mol 木糖）;厭氧发酵产氢菌 CBS-Z可生长的温度为40～90 ℃，最适温度为74 ℃.2） 中温度产氢菌的产氢温度范围一般在25～40 ℃.例如，在培养温度为40 ℃时，厌氧发酵木糖产氢菌FSC-15的产氢量最大;菌株Fanp3在温度为15～35 ℃时，随着温度的升高，氢气产量逐渐增加，最大产氢速率为39.0 mL∙h （每g葡萄糖）;ECU-15在37 ℃时可获得最佳产氢量2.07 mol H（每mol葡萄糖）;HE1在甘油质量浓度为50 g∙L，温度为35 ℃时，可获得最佳产氢量为0.345 mol H（每mol甘油）.3） 低温菌研究主要集中在发酵饲料、乳类食品、环境污水处理、食物保藏等方面.然而，目前对低温产氢菌的筛选、产氢条件以及产氢机理的研究较少.

我国东北地区常年低温，利用中高温发酵进行生物制氢耗能巨大.因此，筛选在低温条件下具有较高产氢能力的厌氧产氢菌，并将其应用于生物制氢生产过程具有重要意义.本研究选取经低温驯化的产氢菌XY-18与常温筛选的产氢菌XY-72的两株菌株，通过间歇实验，在温度为20 ℃的条件下，比较分析了两者的产氢量、pH值、细胞干重和葡萄糖利用率等参数，确定了产氢菌XY-18在低温条件下的产氢能力和低温耐受性，为后续开展深入研究提供参考.

1  材料与方法

菌种来源

在实验室厌氧发酵反应器驯化活性污泥，当其良好的产氢量达到稳定时，收取活性污泥，放置于低温条件下培養，经过3～5代分离、纯化、筛选，获得低温菌株XY-18，经16SrDNA测序和数据库比对，鉴定为.同时，用同样的方法，在常温条件下筛选获得常温菌株XY-72，并鉴定为.

厌氧培养方法

菌株培养中的全部实验操作基本采用了改进的hungate厌氧技术.

培养基

本实验采用LM-1培养基：葡萄糖20 g∙L、牛肉膏2 g∙L、胰蛋白胨4 g∙L、酵母浸粉1 g∙L、磷酸二氢钾1.5 g∙L、氯化钠4 g∙L、六水合氯化镁0.1 g∙L、七水合硫酸亚铁0.1 g∙L、L-半胱氨酸0.5 g∙L、微量元素液10 mL∙L、维生素液10 mL∙L、刃天青0.000 2 g∙L.将琼脂粉15 g添加到1 L液体培养基中获得固体培养基.将配制好的培养基放入灭菌锅中，设置121 ℃，20 min灭菌.

实验装置

本实验用间歇实验装置进行研究，间歇实验装置如图1所示.

分析方法

1.5.1 产气量和产氢量的测定

使用间歇实验装置（图1）测量厌氧发酵产氢菌的产气量.将产氢菌XY-18和产氢菌XY-72按1%的接种量接入100 mL培养基中，置于恒温振荡培养器中，20 ℃，120 r∙min振荡培养，每1 h测定产气量.测定过程中，水准瓶液面与气体计量管液面持平，以保证测定数值的准确性.氢气量测量采用气相色谱法.

1.5.2 pH值和细胞生物量的测定

从间歇实验装置的取样口取出5 mL发酵液，使用pH计测定其pH值.将5 mL发酵液在12 000 r∙min条件下离心5 min，弃上清液，用生理盐水洗2次，105 ℃烘干至恒重，用分析天平称量其质量，即为细胞干重.

1.5.3 葡萄糖含量的测定

采用北京盒子生工科技有限公司生产的葡萄糖含量检测试剂盒（GOPOD Format）测定.葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放出HO.过氧化物酶（POD）催化HO氧化4-氨基安替比林偶联酚，生成红色醌类化合物.实验过程中，通过测定产物在505 nm的吸光度变化，定量葡萄糖含量.

2  结果和分析

随培养时间变化的累计产气量

低温产氢菌XY-18和常温产氢菌XY-72在温度20 ℃条件下的产气量随培养时间的延长逐渐上升（图2）.产氢菌XY-18在培养13 h后开始产气，13～72 h内产气量明显增加，72 h后产气量趋于稳定，96 h内累计产气量达到4 333 mL∙L;而产氢菌XY-72在培养17 h后开始产气，随后各相同时间段的产气量均低于XY-18（图2）.在培养60 h后，产氢菌XY-18累计产气量比XY-72高252.3%，甚至产氢菌XY-18在培养60 h后的累计产气量比产氢菌XY-72在培养96 h后累计产气量高496 mL∙L;在培养96 h后，产氢菌XY-18的累计产气量比产氢菌XY-72的累计产气量高1 873 mL∙L（图2）.由此可知，产氢菌XY-18更适合应用于低温条件下的厌氧发酵.

随培养时间变化的累计产氢量和产氢效率

图3（a）为低温产氢菌XY-18和常温产氢菌XY-72随培养时间的累计产氢量情况.产氢菌XY-18在培养20 h后进入产氢阶段，在24 h内累计产氢量只有46 mL∙L;24～72 h内累计产氢量为2 564 mL∙L;72～96 h内产氢较缓慢，累计产氢量为285 mL∙L.产氢菌XY-72在培养24 h后开始产氢，同时间段其累计产氢量均低于产氢菌XY-18，如图3（a）所示.产氢菌XY-18在44 h内的累计产氢量比产氢菌XY-72在76 h内的累计产氢量高60 mL∙L;产氢菌XY-18在64 h内的累计产氢量比XY-72培养96 h时的累计产氢量高126 mL∙L;在72 h时，产氢菌XY-18累计产氢量比产氢菌XY-72高1 675 mL∙L，如图3（a）所示.

產氢菌XY-18和产氢菌XY-72的产氢效率随着时间先上升，然后达到稳定状态，如图3（b）所示.产氢菌XY-18在20 h内的产氢效率为0.03 mol H/mol葡萄糖，而产氢菌XY-72在20 h内不产氢;产氢菌XY-18在48 h内的产氢效率达到最高（0.69 mol H/mol葡萄糖），比产氢菌XY-72产氢效率高0.07 mol H/mol葡萄糖;在20～72 h内产氢菌XY-72的产氢效率均低于产氢菌XY-18，如图3（b）所示.由此可见，在温度20 ℃下，产氢菌XY-18比产氢菌XY-72产氢能力强.产氢菌XY-18在温度为20 ℃时的产氢时间更长，产氢量更高，产氢效果更好.

随培养时间的生物量变化

产氢菌XY-18和产氢菌XY-72在温度20 ℃下的生物量随培养时间发生变化，如图4所示.产氢菌XY-18在培养12 h后细胞干重增加量为0.42 g∙L;在12～44 h内细胞干重明显增加，从0.42 g∙L上升到1.44 g∙L，这段时间包括对数期和稳定期的初期，说明此时间段菌体生长较快，菌量迅速增加;在44～72 h内，细胞干重在1.44～1.53 g∙L范围内波动;在培养了72 h后，XY-18的细胞干重达到了最大值1.53 g∙L;而在72～96 h内，细胞干重从1.53 g·L降至1.02 g·L.产氢菌XY-18比产氢菌XY-72更早进入产氢阶段，产氢菌XY-72在相同时间段的细胞干重均低于产氢菌XY-18，产氢菌XY-18培养35 h后的细胞干重比产氢菌XY-72培养72 h后大0.16 g·L，如图4所示.因此，从生物量变化看，产氢菌XY-18更适合在低温条件下生长.

发酵过程中的值变化

在温度为20 ℃时，产氢菌XY-18和XY-72的pH值会随培养时间发生变化（图5）.在相同初始pH值和温度的培养条件下，产氢菌XY-18的pH值随着培养时间增加，先减小后增大，而产氢菌XY-72的pH值变化趋势则是逐渐减小（图5）.产氢菌XY-18在培养后pH值开始减小，19 h时，降至5.0，这比产氢菌XY-72提早很多;在19～52 h pH值为4.5;在培养52 h后，pH值突然上升，在72 h时，pH值为4.9;在发酵终止时，pH值为4.8（图5）.通常情况下，产氢菌发酵过程中培养基的pH值过低，这不利于菌体的生长和产氢.因此，及时调节培养基pH值，有利于确保菌体的生长和产氢.当pH值稳定在4.5～4.9时，此时产氢菌XY-18的产氢效果比XY-72的产氢效果好.这表明，产氢菌XY-18生长和发酵产氢的最适pH范围是4.5～4.9.

葡萄糖利用率

产氢菌XY-18和产氢菌XY-72在20 ℃下的葡萄糖利用率情况如图6所示.在发酵产氢过程中，培养基的初始葡萄糖质量浓度为10 g∙L.在培养96 h后，产氢菌XY-18发酵液的葡萄糖质量浓度降至0.04 g∙L，产氢菌XY-72发酵液的葡萄糖浓度降至0.09 g∙L.产氢菌XY-18的葡萄糖利用率为96%，比产氢菌XY-72的高5%.由此可见，产氢菌XY-18比产氢菌XY-72更适合在20 ℃下产氢发酵.

3  结 论

本研究在不同温度条件下通过分离纯化获得了不同的产氢菌，并对其产氢性能进行对比研究.研究发现：在以葡萄糖为底物，温度为20 ℃，初始pH值为6.7和厌氧的条件下，产氢菌XY-18最终累计产氢量比XY-72高1 386 mL·L culture，产氢菌XY-18连续培养72 h获得最大生物量1.53 g∙L;不同菌株的产氢对pH值的要求不同，产氢菌XY-18最佳产氢pH值范围在4.5～4.9，XY-72最佳产氢pH值为5.3～5.5.通过分析产氢量、pH值、生物量等指标得出，产氢菌XY-18具有以下优点：1） 可以在较低的温度生长产氢;2） 有效利用葡萄糖发酵产氢.综合分析得出，产氢菌的产气量与其生物量有关，还受到发酵环境的制约.产氢菌XY-18在低温条件下的产氢性能较好，为后续开展低温条件的发酵产氢研究提供了理论依据，为将来应用于低温处理有机废水提供了可能性.

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（責任编辑：顾浩然，郁慧）

收稿日期： 2021-11-11

基金项目： 上海植物种质资源工程技术研究中心项目（17DZ2252700）;上海市协同创新中心项目 （ZF1205）

作者简介： 徐 叶（1994—），女，硕士研究生，主要从事环境微生物方面的研究. E-mail： 1548271452@qq.com

* 通信作者： 秦 智（1974—），女，教授，主要从事环境微生物技术方面的研究. E-mail： qinzhi@shnu.edu.cn

引用格式： 徐叶， 姜霁珊， 黄志雄， 等. 产氢菌XY-18在低温条件下的产氢性能研究 [J]. 上海师范大学学报（自然科学版），2022，51（1）：64-69.

 XU Y， JIANG J S， HUANG Z X， et al. Research on the hydrogen production performance of cryogenic hydrogen-producing bacteria XY-18 at low temperature conditions [J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：64-69.