苗津东，张丹英，程 雯，俞 瑾，俞超芹

(中国人民解放军海军军医大学第一附属医院中医妇科，上海 200433)

宫颈癌是一种全球范围内发病率和病死率较高的妇科恶性肿瘤，我国每年宫颈癌新发病例高达135 000例，占全球的1/3[1]。绝大多数宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持续感染引起，但越来越多的研究发现宫颈癌发生、发展、浸润和转移是由多因素、多通路共同导致的病理过程[2-3]。其中原癌基因、抑癌基因异常表达及缺氧是目前宫颈癌研究的热点。Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)是Hippo抑癌通路下游的重要蛋白，参与细胞生长、DNA修复等过程[4]。目前发现，YAP1在卵巢癌[5]、结直肠癌[6]等恶性肿瘤中呈高表达，并起到促癌作用。缺氧导致肿瘤细胞表达改变，进而导致肿瘤浸润和转移，这是恶性实体肿瘤的重要基本特征之一[7]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是介导肿瘤细胞低氧反应的关键因子，能够促进肿瘤细胞糖酵解以适应缺氧微环境，从而促进肿瘤微血管形成、生长、转移[8-9]。目前国内外关于YAP1、HIF-1α与宫颈癌临床特征的相关性已有研究报道，但二者对宫颈鳞癌患者预后的评估价值尚未明确。本研究以85例宫颈鳞癌患者为研究对象，采用免疫组织化学法检测YAP1和HIF-1α的表达水平，并探讨其与患者临床特征和预后的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取我院2017年1月～12月收治的85例宫颈鳞癌患者的病灶组织(宫颈癌组)和85例子宫肌瘤患者的正常宫颈组织(对照组)。纳入标准：①宫颈癌组经组织病理学诊断为宫颈鳞癌，对照组经病理学检查诊断为正常宫颈组织；②术前未接受放疗、化疗、靶向治疗或免疫治疗；③临床和随访资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②有宫颈手术史；③失访或其他原因死亡。宫颈癌组患者年龄26～79岁，平均(56.36±12.65)岁；对照组患者年龄24～75岁，平均(54.94±14.02)岁，2组患者年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经我院医学伦理委员会审核(CHEC2017-128)，所有患者对本研究均知情同意。

1.2 方法

所有组织制成厚度4 μm的石蜡切片。采用免疫组织化学法检测组织中YAP1和HIF-1α的表达情况，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，分别以磷酸盐缓冲液和已知抗体阳性样本作为阴性和阳性对照。免疫组织化学法试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人YAP1抗体和鼠抗人HIF-1α抗体均购自美国CST公司。YAP1和HIF-1α均主要表达于细胞浆和细胞核，以该部位出现淡黄色至棕褐色为阳性。YAP1和HIF-1α表达强度以染色强度和阳性细胞率判断。染色强度：无着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计为0分、1分、2分和3分；阳性细胞率：无阳性细胞、阳性细胞率低于10%、阳性细胞率为11%～50%、阳性细胞率为51%～75%、阳性细胞率在75%以上分别计为0分、1分、2分、3分和4分。以上述两者乘积作为最后结果，其中0～3分为低表达，3分以上为高表达。所有免疫组织化学切片和HE染色切片均由2名病理医师评定，结果不一致时经共同商议后确定。

1.3 观察指标

从患者术后出院之日起每月通过电话、微信等方式对患者进行随访，随访时间截至2020年12月。记录所有患者总生存期(overall survival，OS)和无进展生存期(progress-free survival，PFS)。OS指从确诊为宫颈鳞癌至因肿瘤引起患者死亡或随访结束的时间；PFS指从患者接受治疗至宫颈鳞癌进展或患者死亡的时间。分析患者年龄、肿瘤直径、分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移等临床特征与YAP1、HIF-1α表达的关系，并分析两种蛋白表达水平与患者OS和PFS的关系。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同宫颈组织中YAP1和HIF-1α的表达

宫颈癌组YAP1和HIF-1α的阳性表达率分别为81.18%和84.71%；对照组中YAP1不表达，HIF-1α低表达，阳性表达率为1.18%。宫颈癌组YAP1和HIF-1α阳性表达率显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1、表1。宫颈癌组中42例(49.41%)YAP1高表达，46例(54.12%)HIF-1α高表达，高表达率显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 患者YAP1和HIF-1α表达水平[n=85，例(%)]

图1 免疫组织化学法检测YAP1和HIF-1α的表达(×400)

2.2 YAP1和HIF-1α表达水平与临床特征的关系

宫颈鳞癌组织中YAP1表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度有关(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径、淋巴结转移无关(P>0.05)。宫颈鳞癌组织中HIF-1α表达水平与TNM分期、浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者年龄、肿瘤直径、分化程度无关(P>0.05)，见表2。

表2 YAP1和HIF-1α表达与临床特征的关系[例(%)]

2.3 YAP1和HIF-1α表达水平与患者预后的关系

Log-Rank检验发现，YAP1和HIF-1α低表达的患者OS显著长于高表达患者(χ2=16.300、6.062，P=0.000、0.014)，YAP1和HIF-1α低表达的患者PFS显著长于高表达患者(χ2=4.655、4.244，P=0.031、0.039)，见表3、4，图2、3。

表3 YAP1和HIF-1α表达水平与患者OS的关系(月)

表4 YAP1和HIF-1α表达水平与患者PFS的关系(月)

图2 不同YAP1和HIF-1α表达患者OS生存曲线图

图3 不同YAP1和HIF-1α表达患者PFS生存曲线图

3 讨论

宫颈癌已经成为影响全球女性生命的重要危险因素，尽管液基细胞学检测和HPV检测等宫颈癌筛查技术已广泛应用，一定程度上做到了宫颈癌“早筛查、早治疗”，但我国宫颈癌发病率和病死率仍居高不下[10]。因此有必要对宫颈癌的发病机制、进展以及预后影响因素进行深入研究，以探讨宫颈癌诊断、预后评估的新指标及治疗新靶点，进而推动宫颈癌防治的进一步发展。

Hippo信号通路是肿瘤发生过程中的重要通路，与抑癌基因失活密切相关[11]。YAP1是一种原癌基因，其表达产物YAP1在Hippo信号通路中具有中心效应作用。正常生理条件下，YAP1处于磷酸化状态，其转录被抑制，细胞增殖和凋亡处于平衡状态。一旦YAP1过度表达、活性增加，则可激活Hippo信号通路下游靶基因的表达，进而导致细胞异常增殖[12-13]。已有研究发现，YAP1在结肠癌、肝细胞癌[14]等多种实体肿瘤组织中的表达水平异常上调并被活化，活化的YAP1能够诱导细胞增殖、抑制凋亡，从而促进肿瘤发生。本研究显示，宫颈鳞癌组织中YAP1阳性表达率为81.18%，高表达率为49.41%，且YAP1表达水平与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度显著相关。王文慧等[15]的研究发现，宫颈癌组织中YAP1表达与淋巴结转移密切相关，但本研究淋巴结转移患者YAP1阳性表达率与未转移患者比较无显著差异，这可能与纳入样本存在差异有关。本研究进一步分析发现，YAP1低表达患者的OS和PFS显著长于YAP1高表达患者，这可能是由于YAP1表达上调后肿瘤分化程度更高、浸润深度更深，因而患者病情更重、肿瘤病理分期更高，预后更差。恶性实体肿瘤的进展过程对氧的需求量极高，肿瘤细胞生长速度超过血管供氧量时肿瘤病灶极易出现缺氧，进而导致肿瘤细胞内能量供应和消耗失衡，缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)在这一过程中发挥着重要的作用[16]。HIF-1有HIF-1α和HIF-1β两个亚基，HIF-1α发挥氧调节作用，当肿瘤组织周围氧浓度处于正常状态时，HIF-1α和HIF-1β处于游离状态，无生物学活性；一旦出现低氧或缺氧，两个亚基结合为HIF-1，可促进肿瘤微血管形成，提高运氧量，增强肿瘤细胞浸润和转移能力[17]。目前已经在卵巢癌[18]、胰腺癌[19]等多种实体瘤中发现HIF-1α高表达。本研究中，宫颈癌组患者HIF-1α阳性表达率和高表达率显著高于对照组患者，且HIF-1α表达水平与TNM分期、浸润深度和淋巴结转移显著相关，HIF-1α低表达患者的OS和PFS显著长于HIF-1α高表达患者，说明HIF-1α表达上调可能与宫颈鳞癌患者病情较重、预后不良有关。因此，HIF-1α和YAP1表达对于评估患者病情、疗效和生存期具有重要意义。

综上，宫颈鳞癌组织中YAP1和HIF-1α表达较高，与肿瘤分化程度、TNM分期、浸润深度和淋巴结转移等临床特征相关，YAP1和HIF-1α高表达可能提示患者OS和PFS较短，预后不良。但本研究未探讨放化疗、靶向治疗等对YAP1和HIF-1α表达的影响，也未深入分析血清中YAP1和HIF-1α水平以探讨其作为疗效及预后评估指标的可能性，因此未来还需要进行前瞻性研究和体外研究以确定YAP1和HIF-1α表达在宫颈癌诊断、预后评估中的价值。