◎ 欧秋月，李瑞源，何丽芳,，胡孟姣，陆文燕

（1.衡阳师范学院南岳学院生命科学系，湖南 衡阳 421008；2.衡阳师范学院生命科学与环境学院，南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421008）

食品要长时间保存需要防腐剂，但如今使用的防腐剂以人工合成的占多数，长期摄入对人体不利[1-2]。近年来，国内外学者对植物源天然食品防腐剂的研究较多，许多中草药和植物提取物具有广谱的抑菌活性，并作为天然防腐剂应用在某些食品中[3]。黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢产物，其主要存在于能进行光合作用的植物细胞中，有良好的抗氧化、抗菌、抗癌等药理活性[4-6]。阚玉红等[7]分离纯化了胭脂红番石榴叶中的总黄酮，发现番石榴叶黄酮提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有较强的抑制作用。丘苑新等[8]提取了柚树叶总黄酮，发现柚树叶黄酮提取液总还原力比同等质量浓度抗坏血酸的总还原力要高。此外，柚树叶黄酮对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均具有抑制作用。

龙须草又名野席草、马棕根，为灯心草科多年生宿根草本植物，常生于溪渠、湿地、沼泽、河滩等地区，具有清热安神、利尿通淋的效果，是一种民间传统中药材。目前，国内外对龙须草的研究主要是其生境特点、栽培条件和水土维系效益等方面[9-11]，对其组成成分的探究则鲜有报导，有研究表明龙须草中含有香草醛、豆甾醇、菲类和黄酮类物质，但未探讨其抑菌效果[12-14]。

本实验以龙须草为材料，采用微波法和酶法相结合提取龙须草根中的总黄酮，探究龙须草根部总黄酮对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的最低抑菌浓度，并探讨pH值、紫外线和常见金属离子对龙须草根部总黄酮抑菌效果的影响，以期为龙须草根部总黄酮作为天然防腐剂的研发运用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生龙须草（产自福建三明）；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌（南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室提供）；纤维素酶（10 000 U·g-1），购自上海蓝季生物公司；无水乙醇、蛋白胨、氯化钠、酵母浸粉、蒸馏水、柠檬酸、氢氧化钠、琼脂、盐酸和葡萄糖，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1204B电子天平，上海精科天美科学仪器有限公司；SX500高温灭菌锅，Tomy Digital Biology；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DHG-9040A新型电热恒温鼓风干燥箱，宁波江南仪器厂；SPX智能生化培养箱，宁波江南仪器厂；ZQWY-200N振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；DC801真空冷冻干燥机，Yamato Scientific；VS-840-2超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DW-86L416超低温冰箱，青岛海尔生物医疗股份有限公司；TDL-40B台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 龙须草根部总黄酮提取液的制备及含量测定

20 g龙须草根部粉末用2%的纤维素酶处理后，与60%的乙醇按照料液比1∶20（g∶mL），在中低火下微波提取60 s，上清液旋转蒸发定容至50 mL。

采用文献[14]的方法进行芦丁标准曲线的绘制和龙须草根中总黄酮化合物含量检测，得到标准曲线方程：y=28.843x+0.012 8（R²=0.999 0），按照标准曲线回归方程计算龙须草根部黄酮含量为19.40 mg·mL-1。

1.3.2 LB培养基的配制

称取3.5 g蛋白胨，3.5 g NaCl及1.75 g酵母浸粉，置于烧杯中，向烧杯中加入350 mL蒸馏水，用电炉加热，同时用玻璃棒不断搅拌至药品全部溶解。再用10% NaOH溶液调节pH值至7.5，再次定容至350 mL。将配好的LB培养基分装于150 mL锥形瓶中，盖上棉塞，用报纸和棉线包扎好后放入高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。灭菌完后自然晾干，放入阴凉处保存备用。

1.3.3 细菌的活化与菌悬液制备

在无菌条件下，从含有菌种的斜面培养基或培养皿上用接种环刮取一小块菌落，将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的菌种分别接种在新鲜的液体培养基中，37 ℃振荡培养24 h后，用灭菌生理盐水将活化好的供试菌株稀释成浓度为106～107CFU/mL的菌悬液，4 ℃保存备用[15]。

1.3.4 抑菌圈测定与最低抑菌浓度

将培养皿灭菌后烘干，放入超净台，将备用的固体培养基取出，用微波炉加热至没有块状物，稍冷却后在超净台中倒平板。待培养皿中的固体培养基再次凝固后，取活化后的二代菌分别均匀涂布于平板上，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别涂布三皿。

将1.3.1中龙须草根部总黄酮提取液采用二倍稀释法依次稀释，获得浓度为9.700 0 mg·mL-1、4.850 0 mg·mL-1、2.425 0 mg·mL-1、1.212 5 mg·mL-1的龙须草根部总黄酮提取液。取2 mL 70%乙醇放入一个干净的培养皿中作为对照[16-17]。

向装有不同浓度的龙须草根部总黄酮提取液的培养皿中分别放入9片灭菌后干燥的直径为6 mm的滤纸片，浸泡3 min，用镊子夹取滤纸片，小心地甩干滤纸片上的液体，将其平铺于涂布后的平板上。盖好盖子后再用保鲜膜封住开口处，减少杂菌污染的风险。将培养皿放入37 ℃恒温箱中培养24 h，测量抑菌圈，评价不同浓度的黄酮抑菌作用，确定最低抑菌浓度。

1.3.5 pH值对龙须草根部总黄酮提取物抑菌稳定性的影响

用柠檬酸和氢氧化钠溶液将龙须草根部总黄酮提取液调至pH值为3.0、5.0、7.0和9.0，以未处理组（pH值为6.5）作为对照，分别对3种细菌进行抑菌试验，测量抑菌圈，平行测定3次。

1.3.6 紫外线照射对龙须草根部总黄酮提取物抑菌稳定性的影响

将龙须草根部总黄酮提取液在紫外光下分别照射5 min、10 min、15 min、20 min和25 min，以未在紫外光下处理组为对照，分别对3种细菌进行抑菌试验，测量抑菌圈，平行测定3次。

1.3.7 金属离子对龙须草根部总黄酮提取物抑菌效果的影响

将龙须草根部总黄酮提取物加入浓度为1.0 mg·mL-1的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、FeCl2和FeCl3的溶液中，以未处理组作为对照，分别对3种细菌进行抑菌试验，测量抑菌圈，平行测定3次。

2 结果与分析

2.1 最低抑菌浓度测定

最低抑菌浓度是评价有效物质抑菌作用强弱的重要指标，最低抑菌浓度越小，物质抑菌活性越强。采用滤纸片法（滤纸片直径为6 mm）测定抑菌圈直径来评价提取物抑菌作用的强弱。

由表1可知，龙须草根部总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用强于其对大肠杆菌的抑制作用。对于金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌而言，龙须草根部总黄酮提取物的最低抑菌浓度为2.425 mg·mL-1，对于大肠杆菌来说，龙须草根部总黄酮提取物的最低抑菌浓度则大于2.425 mg·mL-1。

表1 龙须草根部总黄酮提取物的最小抑菌浓度表

2.2 pH值对龙须草根部总黄酮提取物抑菌效果的影响

由图1可知，龙须草根部总黄酮提取物的抑菌效果受pH值影响较为明显。pH值为3.0时，根部总黄酮抑菌圈直径减小，与未处理组（pH=6.5）相比，最高减幅达到43.77%，抑菌活性明显降低。pH=5时，与未处理组相比，最高减幅为16.62%，抑菌活性稍有降低。在中性pH值条件下，与未处理组无明显差异，抑菌效果较好；当pH值为9时，与对照组相比，最高减幅达到47.13%，抑菌效果较差。因此，龙须草根部总黄酮提取物在弱酸性及中性条件下的抑菌稳定性很好，但是在强酸性、碱性环境下抑菌效果较差。

2.3 紫外线照射对龙须草根部总黄酮提取物抑菌稳定性的影响

由图2可知，经过不同的紫外线照射时长处理后，龙须草根部提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌圈直径没有明显变化，变化幅度小于11.34%，抑菌活性基本保持稳定。因此，龙须草根部提取物在紫外线照射条件下稳定性良好。

2.4 金属离子对龙须草根部总黄酮提取物抑菌稳定性的影响

如图3所示，Fe2+和Fe3+均能促进龙须草根部总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑制作用，与对照组相比，最高增幅达到43.93%；此外，Na+、K+、Ca2+、Mg2+也能在一定程度上促进龙须草根部总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果，但其对提取物抑制大肠杆菌的效果则无明显影响。这可能是由于许多金属离子可以作为黄酮类物质的配合物增强其抑菌活性[18]，Fe2+和Fe3+与龙须草根部总黄酮的协同作用要强于其他金属离子。

3 结论

本实验以龙须草根为材料，利用酶解和微波辅助法提取龙须草根部的总黄酮，探究龙须草根部总黄酮对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果，结果表明，龙须草根部总黄酮提取物对所述的3种菌皆有一定的抑制作用，且龙须草根部总黄酮提取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用强于其对大肠杆菌的抑制作用。龙须草根部黄酮对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最低 抑菌浓度 分别为 2.425 mg·mL-1、2.425 mg·mL-1、4.850 mg·mL-1。实验还探讨了pH值、紫外线和常见金属离子对龙须草根部总黄酮抑菌效果的影响，结果表明：龙须草根部总黄酮在pH值为5～7、紫外照射、金属离子存在条件下均有较好的抑菌稳定性，并且大多数金属离子在一定程度上能够提高根部总黄酮的抑菌效果，为龙须草根部总黄酮在天然防腐剂领域的研发运用提供基础。