王文昌 ,徐 猛 ,赵益菲 ,张玉芬 ,张晓芳*

(1.河北晨光检测技术服务有限公司,邯郸 057250;2.晨光生物科技集团股份有限公司,邯郸 057250)

陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮[1],具有理气健脾、燥湿化痰等功效,在许多中药复方制剂中均有添加。陈皮的活性成分主要为黄酮类化合物,包括橙皮苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及多甲氧基黄酮(如川陈皮素和红橘素等)[2-5]。目前,陈皮的质量控制主要集中在单一物质即橙皮苷的定性、定量上,如《中华人民共和国药典》2015年版(ChP 2015)将橙皮苷含量作为衡量陈皮质量的一项重要指标。但是采用单一指标成分无法全面评价陈皮饮片质量,无法体现陈皮多成分、多功效的特点。陈皮提取物主要含有挥发油、黄酮等活性成分,作为功能食品基料和药品原料,具有广阔的应用和开发前景。

目前,陈皮及其制品中黄酮类化合物的测定方法主要有薄层色谱法[6]、紫外分光光度法[7]、高效液相色谱法[8-9]和高效液相色谱-串联质谱法[10-11]等。其中,薄层色谱法主要用于鉴别橙皮苷,紫外分光光度法的专属性较差。高效液相色谱法在黄酮类化合物含量测定方面的应用较多,所用流动相主要为乙腈-水体系[1,12-13]和甲醇-水体系[8,14-15],但以甲醇-水体系作流动相时,色谱峰峰形较差,且分析时间长。而鲜有文献对陈皮提取物中活性成分的测定进行报道。

鉴于此,本工作以含乙酸的乙腈溶液作流动相,采用超高效液相色谱法测定陈皮及陈皮提取物中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量,以期为陈皮及陈皮提取物中相应成分的分析检测和质量控制提供方法指导。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

WATERS ACQUITY Arc型超高效液相色谱仪,配2489型紫外-可见检测器;TH-600型超声波清洗器;AUY220型分析天平;DK-98-IIA 型电热恒温水浴锅;FW100型万能粉碎机。

单标准储备溶液:0.4 g·L-1,分别取0.01 g芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷标准品,用甲醇超声溶解后定容至25 mL容量瓶中。

混合标准溶液系列:取适量芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷标准储备溶液,用甲醇逐级稀释,配制成质量浓度分别为2.5,12.5,25,50,100,200,400 mg·L-1混合标准溶液系列。

芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷标准品的纯度大于98%;甲醇和乙腈为色谱纯;冰乙酸为优级纯;试验用水为超纯水,电阻率不小于18.2 MΩ·cm。

陈皮购买于药店,陈皮提取物由本公司自制。

1.2 仪器工作条件

Waters Cortecs C18色谱柱(100 mm×3 mm,2.7μm);柱温35 ℃;流动相为体积比17∶83的乙腈-1%(体积分数,下同)乙酸溶液;洗脱方式为等度洗脱;流量0.5 mL·min-1;进样量3μL;检测波长283 nm;检测时间8 min。

1.3 试验方法

1.3.1 陈皮提取物

取0.04 g(精确至0.000 1 g)陈皮提取物,用甲醇超声溶解并定容至100 mL容量瓶中,过0.22μm滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

1.3.2 陈 皮

将陈皮样品粉碎,使至少95%(质量分数)样品能通过孔径为0.425 mm(40目)的筛网。取筛下物于专用样品袋中,摇晃混匀5 min 以上。取0.5 g(准确至0.000 1 g)样品于具塞锥形瓶中,加入甲醇100 mL,称取质量。于70℃水浴回流90 min,再次称取质量,并用甲醇补足减失的质量,摇匀后静置15 min,取上清液过0.22μm 滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

按照仪器工作条件测定100 mg·L-1混合标准溶液,分别于1 d内连续测定6次和每天测定1次、连续测定6 d,计算测定值的相对标准偏差(RSD),芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等4种黄酮类化合物的日内、日间RSD 分别为0.44%～0.46%和0.42%～0.92%,说明仪器的精密度较好,所得色谱图见图1。

图1 混合标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution

由图1可知,柚皮苷、芸香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的分离度均较好(分离度均大于1.5,拖尾因子为1.0),说明方法的系统适应性良好。

2.2 陈皮取样量的选择

当提取剂甲醇的用量为100 mL 时,考察了陈皮取样量分别为0.5,1.0,1.5,2.0 g时对其中4种黄酮类化合物峰面积的影响。结果显示,陈皮样品中仅检出了芸香柚皮苷和橙皮苷,二者的峰面积均随取样量的增加而降低。因此,试验选择的取样量为0.5 g。

2.3 回流时间的选择

试验考察了回流时间分别为30,60,90,120,150,180 min时对陈皮样品中芸香柚皮苷和橙皮苷峰面积的影响,结果见图2。

图2 回流时间对芸香柚皮苷和橙皮苷峰面积的影响Fig.2 Effect of reflux time on the peak areas of narirutin and hesperidin

由图2可知:两种黄酮类化合物的峰面积随回流时间的延长先增加后减小;当回流时间为90 min时,二者的峰面积均较大。因此,试验选择的回流时间为90 min。

2.4 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以4种黄酮类化合物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,4种黄酮类化合物标准曲线的线性范围为2.5～400 mg·L-1,其他线性参数见表1。

以3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),所得结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度试验

按照试验方法平行制备6份陈皮及陈皮提取物的样品溶液,并分别在1 d和连续6 d(1 d测一个)对其中4种黄酮类化合物进行测定,计算检出成分测定值的RSD。结果显示:陈皮提取物中芸香柚皮苷的日内、日间RSD 分别为0.32%和0.38%,橙皮苷的日内、日间RSD 分别为0.41%和0.43%;陈皮中芸香柚皮苷的日内、日间RSD 分别为0.83%和0.56%,橙皮苷的日内、日间RSD 分别为0.88%和0.60%,说明本方法的精密度较好。

2.6 稳定性试验

按照试验方法制备陈皮及其提取物的样品溶液,均放置0,4,8,12,16,20,24 h后对其中黄酮类化合物进行测定。结果显示,仅检出芸香柚皮苷和橙皮苷,这两种黄酮类化合物测定值的RSD 均小于1.5%,说明样品溶液在24 h内稳定。

2.7 回收试验

按照试验方法分析陈皮,其中芸香柚皮苷和橙皮苷的质量浓度依次为0.020 8,0.136 7 mg·L-1,色谱图见图3。对该样品进行加标(加标量为100倍检出物含量)回收试验,计算回收率,二者的回收率分别为98.7%,99.4%。

图3 陈皮样品的色谱图Fig.3 Chromatogram of the dried tangerine peel sample

本工作采用甲醇提取结合超高效液相色谱法测定陈皮及其提取物中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。该方法精密度和准确度均较好,可用于陈皮及其提取物中芸香柚皮苷、橙皮苷的日常分析和质量控制。