宋玉凤 ,朱俊向 ,于丁一 ,张小军 ,马剑锋

(1.浙江海洋大学 食品与药学学院,舟山 316021;2.浙江省海洋水产研究所 水产品加工与质量安全研究室,舟山 316021;3.青岛农业大学 食品科学与工程学院,青岛 266109;4.重庆艾世特检测技术服务有限公司,重庆 400000)

胆固醇是一种环戊烷多氢菲类衍生物,不溶于水,易溶于甲醇、乙醚等溶剂,广泛存在于动物及人体内。人体内胆固醇大部分来自于自身合成,少部分需要膳食补充,食用过多胆固醇含量高的食物易引发动脉粥样硬化、高血压、冠心病等心脑血管疾病,严重威胁人类的健康[1-2]。通常认为,胆固醇的主要膳食来源为蛋类和肉类制品,却往往忽视了水产品,而水产品中的蟹、贝及虾类中的胆固醇含量普遍偏高。因此,测定和评估水产品中的胆固醇含量,对指导普通消费者和高胆固醇血症患者的科学饮食十分重要。

在1977年人民卫生出版社出版的第二版《食品成分表》中,首次添加了食品中的胆固醇数据,该书经过多次修订,又添加了其他各种食品的胆固醇数据,但这些数据均为比色法测定结果,准确度不高。目前关于食品中胆固醇的检测方法一般为高效液相色谱法(HPLC)[3]、超高效液相色谱法(UHPLC)[4]和气相色谱法(GC)[5]等。由于水产品中胆固醇常以胆固醇酯和游离胆固醇的形式存在[6],这些方法一般先将样品进行皂化处理,使样品中的胆固醇酯水解为胆固醇,然后再测定胆固醇含量。与比色法相比,这些方法减少了样品中胆固醇的损失,但其操作比较复杂、有机试剂用量较大[7-8]。鉴于此,需要提供一种操作简便、绿色环保、提取高效的前处理方法。

液液萃取法具有简单、快速的特点,但其消耗的有机溶剂量较多。针对此问题,有学者设计了双水相体系(ATPS),该方法的提取剂主要为水,操作条件温和,提高了试验人员的操作安全性[9]。双水相胶束体系(ATPMS)为添加了碱性离子液体的ATPS,由于其中含有表面活性剂,当温度超过浊点时,体系将发生相分离,以此来完成目标物的萃取[10]。该方法最初用于蛋白质的分离,随后逐渐用于病毒、脱氧核糖核酸(DNA)、细菌素、抗生素和卟啉等的分离[11],然而,该方法用于胆固醇分离的报道较少,尚无水产品方面的应用研究。

基于文献[12],本工作以具有催化酯交换[13]、糖苷键水解和酯键水解反应[14]性能的碱性离子液体氢氧化1-丁基-3-甲基咪唑盐([C4mim]OH)催化水解水产品中胆固醇酯,用由0.5%(质量分数,下同)1-丁基-3-甲基咪唑乙酸盐([C4mim]Ac)和5.0%(质量分数,下同)Triton X-114组成的ATPMS[介质为柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)]提取胆固醇,得到的胆固醇含量用UHPLC 测定。该方法操作简便、绿色环保、提取高效,可为完善我国水产品脂质营养调查和评价以及推进脂类化合物分析技术的发展提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY 型超高效液相色谱仪;Avanti JXN-30型冷冻离心机;MS-3 型圆周振荡器;HH-S11-6型水浴锅;SK25IO HP型超声波清洗器。

胆固醇标准储备溶液:1 000 mg·L-1,称取胆固醇标准品0.05 g,用无水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中,于4 ℃冰箱保存。

胆固醇标准溶液系列:取适量胆固醇标准储备溶液,用无水乙醇逐级稀释配制成质量浓度分别为5,10,25,50,200 mg·L-1的胆固醇标准溶液系列。

ATPMS:内 含0.5% [C4mim]Ac 和5.0%Triton X-114,介质为柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 7.0)。

[C4mim]OH、1-丁基-3-甲基咪唑咪唑盐([C4mim]Im)、氯化1-丁基-3-甲基咪唑盐([C4mim]Cl)、氯化1-己基-3-甲基咪唑盐([C6mim]Cl)、氯化1-辛基-3-甲基咪唑盐([C8mim]Cl)、1-丁基-3-甲基咪唑磷酸二氢盐([C4mim]H2PO4)、[C4mim]Ac、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氢盐([C4mim]HSO4)等碱性离子液体的纯度均不小于99%;表面活性剂Triton X-114纯度不小于98%;甲醇、乙腈均为色谱纯;胆固醇标准品的纯度不小于98%;其他试剂均为分析纯;试验用水为高纯水。

1.2 仪器工作条件

ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),柱温38 ℃;流动相为甲醇,流量2.0 mL·min-1;进样量5μL;分析波长205 nm;分析时间10 min。

1.3 试验方法

将水产品(草鱼、大黄鱼、鲫鱼、梭子蟹、青蟹、青虾、南美白对虾)肌肉组织搅碎成肉糜状样品,称取0.10 g,加入0.36 mol·m L-1[C4mim]OH 离子液体1 mL,于90 ℃加热30 min,冷却后以5 000 r·min-1转速离心5 min。取全部上清液,加入3 mL ATPMS,加热至浊点,保持3 min,取出下层相,用甲醇定容至5 mL,涡旋30 s,超声5 min。分取1 mL过0.22μm 滤膜,滤液按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 催化水解条件的选择

以大黄鱼为待测对象,以[C4mim]OH、[C4mim]Im、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl、[C4mim]H2PO4、[C4mim]Ac、[C4mim]HSO4催化水解组作为试验组,参考GB 5009.128-2016《食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定》,以0.36 mol·L-1氢氧化钾溶液催化水解组作为对照组,以去离子水催化水解组作为空白组。按照试验方法分析,用方差分析软件对试验组、对照组和空白组结果进行显著性差异分析,结果见图1。其中,柱状图上字母标识一致的代表结果差异不显著(P＞0.05),不一致的代表结果差异显著(P≤0.05)。

图1 不同催化剂的催化效果Fig.1 Catalytic effect of different catalysts

由图1可知:经[C4mim]OH 和[C4mim]Ac催化后得到的胆固醇含量显著高于其他离子液体和空白组的(P≤0.05),其中,[C4mim]OH 催化得到的胆固醇含量高于对照组的,[C4mim]Ac组略低于对照组的。因此,试验选择[C4mim]OH 离子液体来催化水解样品中的胆固醇酯。

试验还考察了催化水解时间分别为10,20,30,40 min,催化水解温度分别为70,90 ℃时大黄鱼中胆固醇含量的变化,结果见图2。

图2 不同水解温度和水解时间下[C4 mim]OH对胆固醇酯的催化效果Fig.2 Catalytic effect of[C4 mim]OH to cholesterol ester at different hydrolysis temperatures and different hydrolysis times

由图2可知,随着催化水解时间的延长,所得胆固醇的含量逐渐上升,30 min后趋于稳定,且90 ℃下的催化效果优于70 ℃下的,因此试验选择在90 ℃下加热30 min 来催化水解样品中的胆固醇酯。

2.2 ATPMS组成的选择

按照试验方法比较了胆固醇在分别由[C4mim]OH、[C4mim ]Im、[C4mim ]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl,[C4mim]H2PO4、[C4mim]Ac、[C4mim]HSO4组成的ATPMS中的分配系数(K),以浊点分相后下层相中胆固醇的质量浓度和上层相的质量浓度的比值计算K,并用方差分析软件进行结果的显著性差异分析,结果见图3。其中,柱状图上字母标识一致的代表结果差异不显著(P＞0.05),不一致的代表结果差异显著(P≤0.05)。

由图3 可知,胆固醇在由[C4mim]Im 或[C4mim]Ac组成的ATPMS中的K显著高于其他离子液体的(P≤0.05),说明这两种离子液体对胆固醇的提取效果较好,因此试验选择以[C4mim]Im或[C4mim]Ac配制ATPMS溶液。

图3 胆固醇在不同离子液体组成的ATPMS中的KFig.3 Values of K of cholesterol in ATPMS with different ionic liquids

在ATPMS中,非离子表面活性剂形成的胶束和水之间存在能量效应的竞争,在熵效应的作用下,体系的微观无序度增加,宏观状态趋于有序和稳定,并在浊点下产生相的分离[15]。ATPMS 的浊点会随着非离子表面活性剂Triton X-114 以及咪唑类离子液体质量分数的变化而变化,因此试验考察了[C4mim]Ac 或[C4mim]Im 的质量分数分别为0.1%,0.5%,1.0%,Triton X-114 的质量分数分别为3.0%,5.0%,7.0%,9.0%时对胆固醇在ATPMS中K的影响,以确定最优的相分离条件,结果见图4。

图4 Triton X-114和离子液体的质量分数对胆固醇在ATPMS中K 的影响Fig.4 Effect of mass fraction of Triton X-114 and ionic liquid on value of K of cholesterol in ATPMS

由图4 可知:当Triton X-114 的质量分数为5.0%时,胆固醇在ATPMS中的K较高,其他质量分数下的均较低;当[C4mim]Ac或[C4mim]Im 的质量分数均为0.5%时的K较高,0.1%时的次之,1.0%时的较低。因此,试验选择5.0% Triton X-114 和0.5%[C4mim]Ac 或[C4mim]Im 来配制ATPMS。

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件分析胆固醇标准溶液系列,以胆固醇的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,所得胆固醇的线性回归方程为y＝2.216×104x+1.773×103,线性范围为5～200 mg·L-1,相关系数为0.999 9。

分别以3 倍、10 倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),并换算为以质量分数计,结果分别为7.5,25μg·g-1。

2.4 精密度和回收试验

按照试验方法对草鱼、大黄鱼、鲫鱼、梭子蟹、青蟹、青虾、南美白对虾样品进行加标回收试验,每种样品平行测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表1。其中:试验组1和试验组2均以[C4mim]OH 为催化剂,分别以[C4mim]Im 和[C4mim]Ac组成的ATPMS为提取剂;对照组参考GB 5009.128-2016以氢氧化钾为催化剂,以甲醇为提取剂。

由 表1可知:试验组2的回收率(84.1%～89.9%)略大于试验组1的(80.0%～83.9%),和对照组的(84.8%～90.0%)接近;试验组1、试验组2和对照组测定值的RSD 基本一致,均小于3.0%。综上,本方法的准确度和精密度较好,可选择结果和对照组更接近的试验组2提取水产品中的胆固醇。

表1 精密度和回收试验结果(n＝5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

本工作以碱性离子液体[C4min]OH 催化水解胆固醇酯,ATPMS提取胆固醇,UHPLC 测定样品中胆固醇的含量,该方法简便、环保、准确可靠,可用于水产品中胆固醇含量的测定。