宋居易 ,陈啸天 ,刘舒芹 ,班 睿 ,向章敏

(1.贵州民族大学 化学工程学院,贵阳 551000;2.广东省科学院测试分析研究所 广东省化学危害应急检测技术重点实验室,广州 510070;3.贵州师范学院 化学与材料学院,贵阳 550018)

砂仁是一种具有较高药用价值的中药材,属于豆蔻属类植物。砂仁中既有挥发性有效成分又有非挥发性有效成分[1-4],其中的挥发性成分有降低血糖[5]、预防阿尔兹海默病[6]、抑菌[7]等作用,因此检测其中的重要活性化学成分(如萜类、黄酮类化合物)及其含量,对于了解其功效价值具有重要意义。当前,一般先采用同时蒸馏法提取砂仁中的挥发性成分,再用一维气相色谱-质谱法、液相色谱-质谱法或紫外分光光度法等对其含量进行测定[8]。然而,这种提取方法存在耗时、能量和试剂消耗大、高温提取影响成分组成等问题。顶空-固相微萃取法(HSSPME)是一种集采样、浓缩、萃取、进样为一体的原位前处理方法,具有快速、高效、低能耗、低消耗、高可靠性等优势[9-10]。然而,HS-SPME由于吸附能力较强,往往需要结合更高通量的色谱来进行后续含量的测定。全二维气相色谱法(GC×GC)是通过正交连接的方式将具有不同分离机制的两个色谱柱连接起来的一种方法,具有分离度更高、峰容量更大的特点,可与HS-SPME联合使用。因此,本工作分别使用HS-SPME和同时蒸馏法提取3个产地共6批砂仁样品中的挥发性成分,并用全二维气相色谱-四极杆飞行时间质谱法(GC×GC-QTOFMS)测定其含量,用统计学软件对两种提取方法进行比较,以期为不同产地砂仁鉴别及活性成分分析提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-7250型气相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱仪;SM1800型全二维气相调制器,配PLS2型多功能三位一体自动进样器;Canvas全二维数据处理系统;BSA224S型分析天平;HAD2513型同时蒸馏萃取装置;自制编织芳环聚合物＠聚多巴胺复合材料(KAP＠PDA)纤维头[11]。

C8～C20的13 种正构烷烃标准品纯度均大于99.9%;二氯甲烷、氯化钠、无水硫酸钠均为分析纯;试验用水为超纯水。砂仁样品采自广东省、云南省和广西省,每地采集两批样品,其中第一批样品编号GZCZL、YN、GX,第二批样品编号JHK、YN-PRT、GX-YL。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 GC×GC条件

柱1为DB-1MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),柱2为DB-17色谱柱(1.0 m×0.18 mm,0.18 μm)。升温程序:初始温度为50 ℃,保持1 min;以6 ℃·min-1升温至250 ℃,保持2 min。恒流模式,流量为1.0 mL·min-1。进样口温度250 ℃;不分流进样;进样时间3 min。

参照固态热调制器原理设置全二维调制器参数[12]。热区1(进口端)升温程序:初始温度为80 ℃,保持1.00 min;以6 ℃·min-1升温至280 ℃,保持2.00 min。冷区升温程序:初始温度为9 ℃;以-50 ℃·min-1降温至-51 ℃,保持16.47 min;以20 ℃·min-1升温至9 ℃,保持15.56 min。热区2(进口端)升温程序:初始温度为170 ℃,保 持1.00 min;以6 ℃·min-1升温至320 ℃,保持10.33 min。调制周期5 s。

1.2.2 QTOFMS条 件

电子轰击离子(EI)源;电离能量70 e V;离子源温度200 ℃,四极杆温度150 ℃,传输线温度280 ℃;扫描范围质荷比(m/z)45～400;采集速率m/z12 500 s-1。

1.3 试验方法

1.3.1 同时蒸馏法-GC×GC-QTOFMS

将干燥的砂仁样品用四分法缩分至5 g,然后用粉碎机粉碎后过孔径为0.42 mm(60 目)的筛网。取30.00 g样品于同时蒸馏装置一端的1 L烧瓶中,再加入50 g氯化钠和300 mL 水,用200 ℃电热套加热。在另一端加入60 mL二氯甲烷并于60 ℃水浴加热,蒸馏3 h。反应结束后,取二氯甲烷相,用无水硫酸钠干燥除水,氮吹去除二氯甲烷,得到的淡黄色液体即为砂仁挥发油,分取10μL 砂仁挥发油于1 mL色谱瓶中,按照1.2节条件进样分析。

1.3.2 HS-SPME-GC×GC-QTOFMS

取砂仁样品5 mg置于20 mL 顶空进样瓶中,用瓶盖密封。设置顶空固相微萃取的条件为平衡温度50 ℃,平衡时间5 min,用KAP＠PDA 纤维头萃取50 min后按照1.2节条件进样分析。

1.4 数据处理

按照与C8～C20的13 种正构烷烃标准品保留时间以及NIST17 数据库的匹配程度进行定性分析。参考文献[13-14],以面积归一化法定量。基于统计学软件SIMCA 14.1和SPSS17.0进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 HS-SPME条件的选择

试验考察了平衡温度分别为30,40,50,60,70 ℃,平衡时间分别为5,10,15,20,25,30 min,萃取时间分别为10,20,30,40,50,60 min时对挥发性成分总峰面积的影响,结果见图1。

由图1可知:砂仁中挥发性成分的总峰面积随平衡温度的升高先增加后减小,当平衡温度为50,60 ℃时,总峰面积较大;在平衡时间5～30 min内,挥发性成分总峰面积的变化幅度较小;在萃取时间10～60 min 内,挥发性成分总峰面积呈阶梯式上升,当萃取时间为50,60 min时,挥发性成分总峰面积较大。综合考虑,试验选择平衡温度50 ℃、平衡时间5 min、萃取时间50 min。

图1 平衡温度、平衡时间和萃取时间对砂仁中挥发性成分总峰面积的影响Fig.1 Effect of equilibrium temperature,equilibrium time and extraction time on total peak area of volatile components in Amomum villosum

2.2 定性与定量分析结果

按照试验方法分析6个砂仁样品中的挥发性成分,并基于文献[11]进行定性分析:①利用NIST17数据库对检出成分进行峰匹配,正匹配度和反匹配度均需大于75%;②保留指数是对10 mg·L-1的C8～C20的正构烷烃标准溶液进行测定,响应值(保留指数)与文献方法的误差应在30以内;③分子离子峰精确质量数实测值与理论值的相对误差的绝对值不超过0.000 2%。满足上述3 个条件下,HSSPME和同时蒸馏法检出的成分分别为162 种和178种。采用面积归一化法进行半定量分析,发现GX、GX-YL、GZCZL、JHK、YN 和YN-PRT 检出成分的峰面积占总峰面积的比例分别为94.21%,95.69%,95.02%,94.42%,95.45%,95.92%(HSSPME)和92.74%,93.39%,90.45%,92.97%,92.06%,91.18%(同时蒸馏法),经过分析发现,共同检出的成分有115种。

对两种方法检出的挥发性成分进行分类和汇总,各类化合物峰面积占总峰面积的比例见表1。

表1 各类化合物峰面积占总峰面积的比例Tab.1 Proportions of peak area of various types of compounds in total peak area %

由表1可知,烯烃类化合物在挥发性成分中占比最高。通过HS-SPME获得的烯烃类化合物和萜类化合物占比明显高于同时蒸馏法的,酯类化合物占比略高于同时蒸馏法的,醇类、酮类和芳香烃类化合物占比低于同时蒸馏法的,其中酮类化合物是由于挥发性较低所致;HS-SPME 在1个样品中检出了吡嗪类化合物,而同时蒸馏法在6个样品中均检出了烷烃类化合物。

HS-SPME 检出的162 种挥发性成分的定性、定量分析结果见表2,其中带“*”标记的为两种方法共同检出的挥发性成分,以面积归一化法计算相对含量。“-”为当前使用的NIST17库没有提供理论值。

由表2可知,相对含量大于1.00%的挥发性成分为香橙烯、倍半香桧烯、乙酸香叶酯、γ-依兰油烯、律草烯、β-倍半萜烯、檀香萜烯、反式石竹烯、反式-α-香柠檬烯、大根香叶烯D、芳樟醇、β-卡丁烯、L-樟脑、α-蒎烯、γ-异丁烯二烯、β-榄香烯、β-红没药烯、二环大根香叶烯、樟脑、消旋龙脑、乙酸龙脑酯、乙酸左冰片酯等,这与文献[15-18]报道结果一致。

表2 HS-SPME检出的砂仁中挥发性成分的定性及定量结果Tab.2 Qualitative and quantitative results of volatile components in Amomum villosum by HS-SPME

表2 (续)

表2 (续)

表2 (续)

表2 (续)

2.3 主成分-判别分析结果

基于文献[19],以两种方法的检出结果分别建立主成分-判别分析法(PCA-DA)模型。PCA-DA模型参数样本数(N)、模型X 轴方向的累积解释率(R2X)以及模型累计预测率(Q2)分别为18,0.762,0.582(HS-SPME)和18,0.926,0.839(同 时 蒸 馏法),其中R2X 大于0.4,Q2大于0.5,说明以两种方法所建的模型性能均较好,同时蒸馏法的略优于HS-SPME的。

采用SIMCA 统计学软件绘制PCA-DA 得分图,以对两种提取方法的鉴别能力进行评价,结果见图2。

图2 两种提取方法所得两批样品的PCA-DA 得分图Fig.2 PCA-DA score graphs of two batches of samples obtained by two extraction methods

由图2可知:HS-SPME 所得第一批样品和第二批样品有明确的区分,且每批样品均能按照产地进行聚类;同时蒸馏法所得第一批样品和第二批样品没有明确的区分,且采集于广东省的第二批样品不能很好地聚集在一起,说明HS-SPME 对产地和批次的鉴别能力高于同时蒸馏法的。

2.4 正交偏最小二乘法-判别分析结果

鉴于此,基于文献[20-23],以正交偏最小二乘法-判别分析法(OPLS-DA)提取造成两种方法差异的主要成分(共22种),建立具有代表性的变量组模型[图3(a)],并进行200次交互验证[图3(b)],以检验模型是否过拟合。提取模型的变量投影重要度(VIP)值,寻找对组间差异贡献较大(VIP值大于1)的成分,所得结果见图3。其中1*,2*和3*为同时蒸馏法检出成分,分别对应1-甲基-4-(6-甲基庚-5-烯-2-亚基)环己-1-烯、3,7,11,11-四甲基双环[8.1.0]十一碳二烯和石竹稀。

图3 两种提取方法所得OPLS-DA 结果Fig.3 OPLS-DA results obtained by two extraction methods

由图3可知:模型参数R2X、模型Y 轴方向的累积解释率(R2Y)、Q2均符合模型良好拟合的条件[图3(a)];R2的模拟值均大于Q2的模拟值,且Q2的回归线的截距为-0.768,小于0.05,说明模型不存在过拟合现象[图3(b)];VIP值大于1.0的成分有22个,可将其作为组间差异性成分[图3(c)]。

在筛选出的22种差异性成分中,HS-SPME 检出的有22种,同时蒸馏法检出的有20种(甲酸龙脑酯和马苄烯酮除外),基于22种差异性成分峰面积的最小值、标准偏差和最大值,利用Excel和Visio软件绘制两种方法的热图,以反映差异性成分在两种提取方法中的响应情况,结果见图4,其中灰度越大,表示响应越大。

由图4 可 知:HS-SPME对消旋龙脑、樟脑、δ-榄香烯、γ-依兰油烯、香橙烯等成分的响应优于同时蒸馏法的,说明HS-SPME 对这些物质的分析效果优于同时蒸馏法的,同理也可以得出同时蒸馏法分析效果较优的物质为α-松油醇、异龙脑、α-卡丁醇等。

图4 两种提取方法检出的22种差异性成分的热图Fig.4 Heat maps of 22 differential components detected by two extraction methods

由表3可知,α-松油醇、α-没药醇、α-香柠檬醇的统计量F值大于1,且检验水平P值小于0.01,说明同时蒸馏法和HS-SPME对这3种成分的分析有极显著性影响,其余物质影响相对较小。

表3 22种差异性成分的方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis of 22 differential components

基于GC×GC-QTOFMS,采用多元统计学方法对分别用HS-SPME和同时蒸法前处理后的砂仁中挥发性成分进行比较。结果表明:同时蒸馏法检出的挥发性成分较多,酮类、醇类和芳香烃类化合物占比较高,烷烃类化合物为特异性检出成分;HSSPME 检出的萜类、烯烃类和酯类化合物占比较同时蒸馏法的高,产地鉴别及产品聚类能力较强;可筛选出22种差异性成分区分两种方法,其中α-松油醇、α-没药醇、α-香柠檬醇为极显著差异成分。在提取砂仁中挥发性成分时,可根据实际应用选择提取方法,推荐采用更加环保、高效、萜类化合物提取量更高的HS-SPME。