周庆安,黄胜斌,莫胜兰,胡丽萍,韩银华,何奇松,马 琳,钟华训,韦显凯,李剑静,施开创,李 军,郭建刚*,李 健 （.广西壮族自治区动物疫病预防控制中心,广西 南宁,53000；.岑溪动物疫病预防控制中心,广西 梧州,54300；3.内蒙古大学 生命科学学院,内蒙古 呼和浩特 00070）

马梨形虫病（epuine piroplasmosis）是由驽巴贝斯虫（Babesia caballi）和马泰勒虫（Theileria equi）寄生于马属动物的红细胞内所引起的血液性原虫病[1],属于一种蜱媒传染病。马梨形虫隶属顶复门（Apicomplexa）梨形虫亚纲（Piroplasmasina）梨形虫目（Piroplasmida）巴贝斯科（Babesiidae）巴贝斯属（Babesia）和泰勒科（Theileriidae）泰勒属（Theileria）[2]。马梨形虫病以高热、贫血、黄疸、淋巴结肿大、死亡等为主要临床症状,呈全世界分布状态,主要分布在欧洲、非洲、亚洲、美洲等大部分热带及亚热带地区[3]。在我国东北、西北、西南、华南等地区均有马梨形虫病感染的报道[4-7]。中国养马历史悠久,马文化底蕴深厚,是养马大国,据统计2019年全国马存栏367.1万匹,占世界总存栏数的6%,位居第5位[8],而广西壮族自治区马属动物养殖地区主要分布在防城港、百色、河池、崇左等山区地区,主要以家庭散养方式为主。

18S r RNA基因是编码真核生物核糖体小亚基的DNA序列,包括其中能体现种之间的亲缘关系的保守序列区域,也包括能区分种间差异的变序列区域,因此用于种属以上的分类分子标志。巢式PCR分子方法可用于较多样本的检测,较传统的方法可以避免主观因素的影响。梨形虫病是影响养马业和相关马术比赛的发展,广西对马属动物的梨形虫病调查较少,因此,本试验根据巴贝斯虫和泰勒虫18S r RNA保守基因序列设计2对特异性引物,运用巢式PCR分子方法对马属动物全血梨形虫开展分子流行病学调查,为广西壮族自治区马属动物梨形虫病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1样品信息于2019年1月至2020年10月在广西壮族自治区防城港市、百色市、崇左市、河池市等4个地级市辖区的马属动物进行颈静脉采集全血,置于EDTA真空抗凝管,混均匀后,冷藏保存,带回实验室检测。各市马属动物全血采集情况见表1。

表1 马属动物全血采集信息表

1.2主要试剂及仪器TGuide S32磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒、2×Tap plus PCR Maste mix、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、TGuide S32核酸抽提仪购自北京天根公司,DH5α感受态细胞、p MDTM18-T克隆载体、DL2000 DNA Marker购自Ta KaRa,Bionetra TONE PCR仪购自德国耶拿公司,UVITEC凝胶成像系统购自英国UVItec公司,电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1.3引物合成运用巢式PCR方法扩增马属动物梨形虫原虫18S r RNA部分基因,引物序列参考文献[9]根据巴贝斯虫和泰勒虫18S r RNA基因序列信息设计的通用引物,引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.4全血核酸抽提取200μL马属动物全血按照TGuide S32磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒说明书抽提核酸后,保存于—20℃待检测。

1.5目的基因扩增体系及反应条件运用巢式PCR方法根扩增目的基因,第1、2轮扩增反应体系和条件一样。反应体系25μL:2×Taq Master Mix 12μL,dd H2O 9μL,上、下游特异性引物各0.5μL,抽提核酸3μL,第2轮PCR反应体系模板为第1轮PCR产物。在95℃5 min；94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,34个循环；72℃10 min条件下运行完成扩增。取7μL第2轮PCR产物加入1.5%的琼脂糖凝胶,放入电泳仪在100 V、66 m A条件下30 min电泳后,在凝胶成像系统观察是否有特异性亮带。

1.6梨形虫18S r RNA部分基因序列测序目的基因切割后,运用大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收梨形虫目的基因,并连接至p MDTM18-T载体,在16℃条件下过夜后,转化至DH5α感受态细胞。接种至LB固定培养基后挑选可疑阳性菌落扩大培养,再回收重组质粒,经鉴定是阳性后,送至广州艾基生物技术有限公司。

1.7序列分析和系统发育树的建立通过测序获得的序列与NCBI中注册的序列进行同源性对比,分析所得的序列是否为目的基因以及梨形虫病原体种类,并和GenBank上登录的泰勒虫和巴贝斯虫18S r RNA基因序列相似度比较,选东方泰勒虫（MH208642）、环形泰勒虫（MG599091）、中华泰勒虫（MT271905）、尤氏泰勒虫（JF719835）、鹿泰勒虫（KT959227）、绵羊泰勒虫（MN493111）、吕氏泰勒虫（LC326007）、牛巴贝斯虫（KY805833）、莫氏巴贝斯虫（AY260179）、卵形巴贝斯虫（MN900525）、双芽巴贝斯虫（MH050358）、马泰勒焦虫（MH651216、MG052901）、Colpodellasp.（KT600661、MH20-8617）、C.tetrapymenae（AF330214）作 为 参 照 序列,选同为梨形虫目的猫胞簇虫（Cytauxzoon felis,L19080）作为外类群,用MEGA5.2软件中的Neighbor-Joining Tree,经过1 000次的Bootstrap计算,构建系统发育树。

2 结果

2.1梨形虫18S r RNA基因PCR扩增结果经特异性引物扩增后,取PCR产物进行电泳后,在凝胶成像系统可观察到约438 bp片段亮带,与预期片段大小相符（图1）。

图1 特异引物扩增的PCR产物

2.2各市马属动物梨形虫感染情况在4个市10个县的马属动物样品中,除了凭祥市未检出梨形虫外,其他区域均检出梨形虫,平均感染为26.54%,最高感染率为76.47%。各市县具体感染情况见表2。

表2 各地区梨形虫感染情况 %

2.2梨形虫感染种类情况及序列分析结果经序列分析,NCBI序列比对,序列分别与马泰勒焦虫、东方泰勒焦虫、瑟氏泰勒焦虫、Colpodellasp.、Sarcocystis gjerde相似度较高,其中马泰勒焦虫30株、东方泰勒焦虫7株、瑟氏泰勒焦虫2株、Colpodellasp.3株、Sarcocystis gjerdei1株。基于18S r RNA基因序列构建的系统进化树得出2个大分支:泰勒虫属、巴贝斯虫属分支和Colpodellasp.分支。相应的种类分别与该病原相似度较高的参考序列在同一小分支（图2）。

图2 基于18S r RNA基因梨形虫不同种类的进化树

3 讨论

马梨形虫是国际马病疫情监测病种之一,近几年一些国家偶有发生或首次发现该病[10]。目前,通过常规监测可以有效预防梨形虫病。本次对广西壮族自治区防城港、崇左、百色、河池等地区的马属动物梨形虫进行监测,发现平均感染率为26.54%,马泰勒焦虫为优势种,未监测出弩巴贝斯虫,较新疆部分地区的马属动物略低[5],比邻省广东省、云南省部分地区的马属动物感染率略高[6-7]。广西壮族自治区防城港、崇左、百色、河池等一些区域地处山区,且防城港、崇左、百色地处中越边境,边境线较长,与越南接壤,而越南边境地区动物防疫薄弱,会增加马梨形虫病传入我国的风险。

本次马属动物梨形虫的监测运用巢氏PCR方法检测,并进行基因测序与NCBI相关种类相似度比较。在所成功的序列中除了与泰勒焦虫属的马泰勒焦虫、东方泰勒焦虫和瑟氏泰勒焦虫种类相似度较高外,还有1株与肉孢子属的种类相似度高达99.77%以及3株Colpodellasp.Colpodellids门与顶体复合物门相近的一个姊妹世系,形态很相似[11]。Colpodellasp.是一种人畜共患的新发病原体,2012年在我国昆明首次发现Colpodellaspp.样病原体感染人的病例[12],在一些动物的排泄物、小牛腹泻物、鸵鸟排泄物中的卵囊、人类的血液、蜱虫均分离到Colpodellaspp.[11-13],这次在靖西和那坡的马属动物也检到Colpodellasp.,与参靠序列同源性相似度为98%,同属于进化分支。

以上调查结果及序列分析表明,广西部分马属动物梨形虫携带率高,种类多,还涉及一种人兽共患新发病原体,因此在防治马属动物血液原虫的同时,也引起公共卫生的足够重视。