陈东 蒋知新 张洁 史春夏

(1.中国人民解放军第305医院肾脏内科，北京 100017；2.中国人民解放军第305医院中心实验室,北京 100017；3.首都医科大学附属北京潞河医院肾内科,北京 101149)

糖尿病肾病是糖尿病并发症之一，目前尚未有针对糖尿病肾病的特定治疗方法，因此，需深入研究其发病机制以开发合适的治疗策略及药物[1-2]。中药是防治糖尿病肾病的重要方式之一[3-4]。桃叶珊瑚苷(Aucubin，AU)又名杜仲苷，是从中草药中提取出的天然活性物质，一种环烯醚萜类化合物，具有良好的抗炎和抗氧化作用[5-6]。研究报道桃叶珊瑚苷可抑制血肿周围脑组织中TNF-α的表达[7]。桃叶珊瑚苷可能通过抑制MAPKs炎症信号通路，保护血管内皮细胞免受脂多糖诱导的损伤[8]。桃叶珊瑚苷可以改善肝脏缺血再灌注损伤和脑损伤中的炎症和氧化应激反应[9-10]。然而桃叶珊瑚苷对肾小管上皮细胞炎症损伤的影响及机制尚不清楚。研究[11]报道miR-374可能参与糖尿病性视网膜病的血管生成。2型糖尿病患者血清中miR-374高表达[12]。但miR-374对肾小管上皮细胞炎症损伤的影响尚未清楚。本研究探讨桃叶珊瑚苷和miR-374对肾小管上皮细胞炎症损伤的影响及桃叶珊瑚苷是否通过调控miR-374的表达影响高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤。

1 材料与方法

1.1 实验材料 肾小管上皮细胞HK-2(美国ATCC)；DMEM培养液(美国Genmed)；葡萄糖(美国Sigma)；桃叶珊瑚苷(HPLC≥98%，上海宝曼生物科技有限公司)；IL-6、TNF-α酶联免疫吸附试剂盒(ELISA)(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(日本同仁)；蛋白提取试剂盒(美国Invent)；荧光定量PCR试剂盒(美国Thermo fisher)。

1.2 细胞培养与分组 用DMEM培养液培养肾小管上皮细胞HK-2，待细胞生长至80%左右时，用终浓度为5.5mmol/L葡萄糖[对照(Con)组]、25mmol/L葡萄糖[高糖(HG)组]处理HK-2细胞，用25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L桃叶珊瑚苷和25mmol/L葡萄糖[桃叶珊瑚苷低、中、高浓度(HG+AU-L、M、H)组]处理HK-2细胞，48 h后收集细胞备用；将miR-NC、miR-374转染至HK-2细胞后用25mmol/L葡萄糖处理，记为HG+miR-NC组、HG+miR-374组；将anti-miR-NC、anti-miR-374转染至HK-2细胞后用100 μmol/L桃叶珊瑚苷和25mmol/L葡萄糖处理，记为HG+AU+anti-miR-NC组、HG+AU+anti-miR-374组。

1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-6、TNF-α水平 收集各组细胞上清液，按试剂盒说明操作。

1.4 流式细胞术检测肾小管上皮细胞凋亡情况 收集各组细胞，加300 μL结合缓冲液，按试剂盒说明操作，上流式细胞仪，检测细胞凋亡率。

1.5 Western blot法检测Bcl-2和Bax的蛋白表达 提取各组细胞总蛋白，定量后通过SDS-PAGE分离蛋白，转膜，封闭，加入Bcl-2和Bax一抗在4℃条件下孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，暗室曝光显影，定影，分析蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参计算蛋白表达水平。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-374表达水平 提取肾小管上皮细胞的总RNA，合成cDNA，设计合成引物，按试剂盒说明进行PCR扩增，反应结束后根据扩增曲线数据，按照公式2-△△Ct法[△△Ct=(Ct目的-Ct内参)-(Ct对照组-Ct内参)]计算miR-374的相对表达量。

2 结果

2.1 桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞炎症因子表达的影响 与Con组比较，HG组HK-2细胞中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；与HG组比较，桃叶珊瑚苷低、中、高浓度组HK-2细胞中IL-6、TNF-α水平降低，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞炎症因子表达的影响

2.2 桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响 与Con组比较，HG组HK-2细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高(P<0.05)；与HG组比较，桃叶珊瑚苷低、中、高浓度组HK-2细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，呈浓度依赖性(P<0.05)。见图1，表2。

表2 桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响

2.3 桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞miR-374表达的影响 与Con组比较，HG组HK-2细胞中miR-374表达水平降低(P<0.05)；与HG组比较，桃叶珊瑚苷低、中、高浓度组HK-2细胞中miR-374表达水平升高，呈浓度依赖性(P<0.05)。见表3。

表3 桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞miR-374表达的影响

2.4 miR-374过表达对高糖诱导的HK-2细胞炎症损伤的影响 与HG+miR-NC组比较，HG+miR-374组HK-2细胞中miR-374表达水平升高，IL-6、TNF-α水平降低，HK-2细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低(P<0.05)，见表4、图2。

表4 miR-374过表达对高糖诱导的HK-2细胞炎症损伤的影响

图2 miR-374过表达对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的影响

2.5 抑制miR-374表达逆转了桃叶珊瑚苷(100 μmol/L)对高糖诱导的HK-2细胞炎症损伤的作用 与HG+AU+anti-miR-NC组比较，HG+AU+anti-miR-374组HK-2细胞中miR-374表达水平降低，IL-6、TNF-α水平升高，HK-2细胞凋亡率升高，Bcl-2表达水平降低，Bax表达水平升高(P<0.05)，见图3，表5。

图3 抑制miR-374表达逆转了桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞凋亡的作用

表5 抑制miR-374表达逆转了桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞炎症损伤的作用

3 讨论

肾小管损伤在糖尿病肾病中起着重要作用，且不同炎症因子都参与其中，其中肾小管上皮细胞能分泌多种细胞因子，导致间质炎症和纤维化的发生，介导糖尿病肾病发生与发展；而中药成分在治疗糖尿病肾病中有显著优势，干预糖尿病肾病的炎症机制[13-17]。桃叶珊瑚苷是一种具有来源丰富，安全性良好和有益生物活性众多的化合物，具有很高的潜在价值，可用于保健产品和药品[18]。桃叶珊瑚苷可通过NF-κB通路抑制LPS/IFN-γ诱导的BV2小胶质细胞中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的水平[19]。桃叶珊瑚苷可减少急性肺损伤小鼠肺内TNF-α表达，增加抑炎因子IL-10的表达，从而减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[20]。桃叶珊瑚苷通过下调Bax、Caspase-3表达上调Bcl-2表达，抑制HaCaT细胞凋亡[21]。以上研究均表明桃叶珊瑚苷具有抗炎及保护细胞免受损伤的作用。本实验用高糖处理HK-2细胞模拟体外糖尿病肾病模型，然后用不同浓度桃叶珊瑚苷处理，结果显示，IL-6、TNF-α水平及细胞凋亡率降低，Bcl-2表达水平升高，Bax表达水平降低，呈浓度依赖性；IL-6、TNF-α是主要的的促炎因子，其高水平加剧炎症反应[22]；因此，本实验表明桃叶珊瑚苷可浓度依赖性的抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和炎症反应，即桃叶珊瑚苷可抑制高糖诱导的HK-2细胞炎症损伤。提示，桃叶珊瑚苷可能是一种有希望的糖尿病肾病的防治中药。

研究表明[23]miRNA可参与调控肾小管上皮细胞损伤过程。研究报道[24]miR-374通过靶向Wnt5a改善脑缺血再灌注损伤。miR-374过表达可防止胸腔硬膜外麻醉后小鼠心肌缺血-再灌注损伤[25]。miR-374可以通过激活PI3K / Akt通路靶向SP1，减轻七氟醚预处理的大鼠心肌缺血再灌注损伤[26]。本实验结果显示，高糖诱导的HK-2细胞中miR-374表达水平降低；过表达miR-374后，IL-6、TNF-α水平降低，细胞凋亡率降低，表明过表达miR-374后抑制了高糖诱导的HK-2细胞凋亡和炎症反应。此外，本实验发现不同浓度桃叶珊瑚苷可提高miR-374的表达水平高，而抑制miR-374表达逆转了桃叶珊瑚苷对高糖诱导的HK-2细胞炎症损伤的作用。

4 结论

本实验结果提示，桃叶珊瑚苷通过上调miR-374表达抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞炎症损伤。