氨氮胁迫对杂交鲟脑、鳃及血清的生理影响

2022-02-24孟沛艺刘晓林张艺平吕频频张春暖

河南科技大学学报(自然科学版) 2022年3期

齐茜，师顺，黄勇，刘洋，刘勇，孟沛艺，刘晓林，张艺平，吕频频，张春暖

(河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471023)

0 引言

氨氮主要以离子态氨(NH4+)和非离子态氨(NH3)两种形式广泛存在于水环境中。低浓度氨氮对鱼类的生存繁殖没有明显的影响，但是由于环境污染及集约化养殖，很多养殖水体中的氨氮含量已经超过了正常范围，导致氨氮在鱼体内过度积累，进而影响其正常生理机能，这可能是导致鱼类死亡的真正原因[1-6]。已有研究表明：氨氮胁迫会不同程度造成金头鲷(Sparusaurata)、团头鲂(Megalobramaamblycephala)、淇河鲫(Carassiusauratus)、虎斑乌贼(Sepiapharaonis)、花椒鼠(Corydoraspaleatus)和草鱼(Ctenopharyngodonidellus)等鳃、脑组织出现细胞肿大、核偏移溶解和空泡化等损伤现象[7-13]，能诱导鱼体组织抗氧化相关酶活性变化，例如,翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、泥鳅(Paramisgurnusdabryanus)、鲻鱼(Mugilcephalus)、青鱼(Mylopharyngodonpiceus)、圆斑星鲽(Veraspervariegatus)等[6,11-17]，以及一系列炎症反应，例如，大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)、翘嘴鳜、泥鳅、瓦氏黄颡鱼、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)等[5-6,14,18-19]。研究表明：不同鱼类的氨氮耐受性可能与自身的氮代谢途径或生活的水层有关，其氨氮耐受能力存在明显差异，也暗示不同鱼类的氨氮调节机制不同[8-9]。因此，探究氨氮对鱼类的毒性效应，对揭示氨氮胁迫对鱼类的毒性作用机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用杂交鲟(体质量(50.24±0.50) g)来自安阳自繁群体，试验开始前取健康无病、规格基本一致的180尾杂交鲟于60 cm×30 cm×40 cm的玻璃缸中暂养7 d，水温(21±0.5) ℃，pH7.5，溶解氧 6～8 mg/L，每天投喂2次，投饵率2%。暂养结束后，将试验鱼随机分为3组(对照组0 mg/L；低质量浓度组 10 mg/L；高质量浓度组 50 mg/L)，每组3个重复，每个重复20尾。

1.2 试验设计与样品采集

试验开始前2天停止投喂，以10 g/L NH4Cl母液调整至试验设计的氨氮质量浓度，每隔24 h换水1/3，氨氮胁迫时长为48 h，恢复48 h(即试验第96 h)。其间内循环，养殖条件同暂养条件，每隔8 h采用那纳氏试剂比色法检测水体氨氮质量浓度。在试验0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和96 h时，每桶分别随机选择3尾杂交鲟采样。首先,用50 mg/L MS-222进行轻度麻醉，进行尾静脉采血，全血离心10 min制备血清；然后，取鳃丝用液氮速冻后，-80 ℃保存备用；最后，取鳃丝、脑组织用磷酸盐缓冲液漂洗，Bouin氏液固定保存。

1.3 试验方法

脑组织与鳃组织经Bouin氏液固定过夜,用于制作石蜡切片，具体步骤如下：过夜后样本先用梯度乙醇(体积分数分别为70%、80%、90%、95%、100%)逐级脱水，再用1/2二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明,石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(hematexylin-eosin，HE)染色，最后用显微观察并拍照。

血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及鳃丝Na+/K+-ATP均采用南京建成科技有限公司测试盒测定。取0.1 g样品加入9倍体积的预冷生理盐水，研磨成组织匀浆，4 ℃下3 000 r/min离心10 min，制备待测样本，然后按试剂盒说明进行操作。

采用索莱宝试剂盒提取鳃丝总RNA，然后使用HIFIscript cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录合成cDNA。基于美国国家生物信息中心数据库鲟鱼杂交种的亲本获得白介素1β(interleukin 1 beta，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)基因开放阅读框序列，以β-actin为管家基因，在美国国家生物信息中心数据库的Primer-BLAST程序中完成引物设计，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系(20.0 μL)：2X Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.2 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃、 105 s，60 ℃、1 min，72 ℃、32 s，进行40个循环；60 ℃、30 s，95 ℃、15 s。采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量[22]。

表1 杂交鲟炎症反应相关基因与内参基因的实时荧光定量PCR引物序列

1.4 数据统计与分析

利用Microsoft Excel软件进行数据初步处理；利用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan’s多重比较，结果用均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 氨氮胁迫对杂交鲟大脑组织结构的影响

不同质量浓度氨氮胁迫下脑组织切片的变化分别如图1和图2所示。对照组脑组织可见清晰的粉红色神经纤维，以及被神经纤维包裹的分泌细胞、支持细胞，且细胞无破损，神经纤维排列紧密(见图1a)。胁迫6～12 h时，高、低质量浓度组，部分神经细胞肿大，同时伴随细胞核偏移现象，部分分泌细胞的细胞核溶解(见图1b、图1c、图2b和图2c)。胁迫24 h时，支持细胞几乎消失不见，神经纤维开始解体，神经细胞出现大面积溶解(见图1d和图2d)。胁迫48 h时，低质量浓度组神经纤维解体现象明显，并且伴有神经元坏死的现象(见图1e)，高质量浓度组神经纤维解体现象更加严重，神经细胞破裂、细胞核溶解现象大面积发生(见图2e)。解除氨氮胁迫恢复48 h后，低质量浓度组神经纤维破损解体现象发生很大程度的缓解，同时支持细胞也出现在视野内，但神经细胞肿胀现象依旧存在(见图1f)，相比低质量浓度组，高质量浓度组恢复效果不明显，神经纤维破损依旧严重，且分泌细胞数量减少，并且分泌细胞肿胀现象明显，支持细胞数量稀少(见图2f)，脑组织受损情况依然严重。

(a) 对照组

2.2 氨氮胁迫与恢复对杂交鲟鳃组织结构的影响

不同质量浓度氨氮胁迫下杂交鲟鳃组织切片的变化如图3和图4所示。对照组，鳃丝排列整齐，仅有少量的分泌物(见图3a)。高、低质量浓度组，胁迫6～12 h时，鳃丝颜色均变淡，边缘出现不整齐及肿胀现象，同时表面分泌物增多，泌氯细胞和上皮细胞中开始出现核溶解以及细胞空泡化(见图3b、图3c、图4b和图4c)。胁迫24 h时，细胞核溶解以及细胞空泡化现象进一步加剧，且高质量浓度组较低质量浓度组严重(见图3d和图4d)。胁迫48 h时，低质量浓度组鳃丝变短，且鳃丝间距继续增大，鳃表面上皮细胞排列紊乱现象大面积出现，同时细胞空泡化现象更为严重，鳃丝出现严重损伤变短，且鳃丝界限开始不易分辨(见图3e)；高质量浓度组，鳃丝边缘模糊不清难以分辨，上皮细胞水性变肿，且大面积脱落，鳃丝变短、肿胀且相邻鳃丝间距增大(见图4e)。解除氨氮胁迫恢复48 h后，低质量浓度组鳃的恢复情况良好，鳃表面分泌物减少，泌氯细胞完整，上皮细胞排列整齐，基本恢复到胁迫前水平(见图3f)；而高质量浓度组虽有所缓解，但并未恢复到氨氮胁迫前的水平，泌氯细胞和上皮细胞的细胞核溶解，细胞空泡化现象依然存在(见图4f)。

(a) 对照组

2.3 氨氮胁迫与恢复对杂交鲟幼鱼鳃丝Na+/K+-ATP酶活性的影响

与对照组相比，低质量浓度组和高质量浓度组Na+/K+-ATP酶活性均呈现下降-升高-降低的变化趋势(见图5)，其中，低质量浓度组在胁迫12 h达到最低值，而高质量浓度组在胁迫6 h达到最低值，均与对照组差异显著(P<0.05)。胁迫12 h后，高、低质量浓度组Na+/K+-ATP酶活性上升且在48 h达到最大值。解除氨氮胁迫恢复48 h后，两个试验组再次下降，与对照组差异不显著(P>0.05)。

注：小写字母不同表示两者之间存在显著性差异(P<0.05)，下同。

2.4 氨氮胁迫与恢复对杂交鲟血清抗氧化指标的影响

经过不同氨氮质量浓度胁迫后，杂交鲟幼鱼血清中的抗氧化指标随时间变化如图6所示。胁迫6 h，低质量浓度组和高质量浓度组血清的SOD、CAT和GSH-Px酶活性较对照组显著升高(P<0.05)。胁迫12 h，SOD降至最低点。胁迫24 h，GSH-Px降至最低点；解除氨氮胁迫恢复48 h后，3种酶活性降低均有恢复趋势，其中，低质量浓度组的SOD与对照组依旧差异显著(P<0.05)，而CAT和GSH-Px与对照组无显著差异(P>0.05)，高质量浓度组SOD和GSH-Px与对照组无显著性差异(P>0.05)，而CAT与对照组差异显著(P<0.05)。MDA含量胁迫6 h与对照组无显著变化(P>0.05)，低质量浓度组24 h升高至最大值，高质量浓度组12 h升高至最大值，而解除氨氮胁迫恢复48 h后，低质量浓度组与对照组无显著性差异(P>0.05)，高质量浓度组显著高于对照组(P<0.05)。

图6 氨氮胁迫与恢复对杂交鲟幼鱼血清抗氧化指标的影响

2.5 氨氮胁迫与恢复对杂交鲟鳃丝炎症相关因子的影响

在高、低质量浓度氨氮胁迫组，杂交鲟幼鱼鳃丝IL-1β基因和TNF-α基因表达量呈现先升高后降低的趋势(见图7)。胁迫12 h，高、低质量浓度组IL-1β基因相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。胁迫6 h，高浓度组TNF-α基因相对表达量显著升高(P<0.05)。胁迫12 h，低质量浓度组TNF-α基因相对表达量显著升高，且显著高于对照组(P<0.05)。解除氨氮胁迫恢复48 h后，IL-1β基因和TNF-α基因相对表达量显著下调，低质量浓度组与对照组差异不显著(P>0.05)，而高质量浓度组仍显著高于对照组(P<0.05)。

(a) IL-1β基因 (b) TNF-α基因

3 讨论

脑是鱼的神经中枢，是调控机体各系统的最高中枢。文献[23]研究表明：高质量浓度的氨氮胁迫会对神经细胞造成损伤，甚至导致神经细胞死亡。脑组织中的胶质细胞在氨氮胁迫过程中发生肿胀变性，最终导致脑组织发生氧化损伤而死亡[1]。在对淇河鲫鱼的研究中发现，氨氮胁迫可以破坏脑组织中的神经纤维，神经细胞体不同程度坏死，导致其神经系统功能发生障碍[9]。在对鲤鲫鱼的研究中，发现氨氮会对脑组织中的血液循环产生影响，阻碍神经细胞分泌神经递质，从而导致机体各种代谢途径受阻[24]。本研究中，杂交鲟幼鱼经过不同质量浓度的氨氮胁迫后，其脑中神经纤维出现不同程度的破坏，分泌细胞和支持细胞部分细胞核溶解并空泡化，尤其是高质量浓度胁迫下更为严重，与淇河鲫鱼情况相近；解除氨氮胁迫恢复后，高质量浓度组的恢复效果远不如低质量浓度组。以此推断氨氮胁迫对脑细胞的损伤可能破坏杂交鲟幼鱼机体神经活动，影响神经递质的合成以及释放，进而影响到机体其他系统的功能正常运转，而且随着氨氮质量浓度增大，对神经系统的损伤越来越严重且难以恢复，从而对杂交鲟鱼的生存和生长产生阻碍甚至导致死亡。但是，氨氮影响的是何种神经递质的合成及释放还需要做进一步探究。

鳃是杂交鲟幼鱼重要的呼吸器官，并且直接参与外界环境与内环境之间的物质交换过程，同时也是重要的调节水盐平衡和新陈代谢的器官。因此，外界环境变化对鳃组织的影响尤为明显。针对鲫鱼和花椒鼠的研究表明，长期暴露于有毒有害物质中，鳃组织更容易遭受明显的损伤，其损伤情况与本研究类似。本试验中，无论高质量浓度或低质量浓度的氨氮胁迫都会导致鳃丝组织上皮细胞紊乱，泌氯细胞等细胞出现水肿、细胞核溶解和空泡化，鳃丝变短，鳃丝基部出现不同程度的充血，鳃丝之间的距离增大。文献[13]研究了草鱼氨氮胁迫对鳃组织的损伤，与本试验中杂交鲟相比，草鱼的鳃组织受损情况更加严重，可能和鱼本身的氨氮耐受性有关。不同质量浓度氨氮胁迫的恢复过程中，高质量浓度的氨氮胁迫难以恢复到胁迫前水平，但相比较脑组织，鳃的恢复能力要更强。

Na+/K+-ATP酶作为鳃组织上泌氯细胞和细胞器膜上的一种重要的蛋白酶，对于鱼体渗透调节作用具有非常特殊的作用[15]。本研究中，随着氨氮胁迫的持续，鳃丝的Na+/K+-ATP酶活性呈先降低再升高又降低的变化趋势，且高质量浓度组比低质量浓度组下降速度更快。这与鲻鱼(Mugilcephalus)的慢性氨氮胁迫研究结果相同，在较高质量浓度胁迫下，非离子氨氮对鳃丝的直接损伤加重，导致鳃丝细胞膜磷脂过氧化，进而造成生物膜功能和结构的完整性受损，同时Na+/K+-ATP酶活性受到抑制[15]。在低盐度胁迫下的银鲳鱼(Pampusargenteus)试验中也发现，Na+/K+-ATP酶活性受环境胁迫的抑制作用具有时序性，氨氮胁迫的持续作用能刺激机体的主动渗透调节机制，而且渗透调节机制作用效果随胁迫质量浓度变高而增强[25]。本试验也与青鱼和圆斑星鲽的研究结果相近，胁迫初期由于水体中高质量浓度氨氮通过渗透作用进入机体，机体氨氮排泄过程受阻，通过影响Na+/K+-ATP酶蛋白结构使酶活力降低，之后鱼体内渗透压不断提高激活体内渗透机制，机体通过主动渗透调节使得酶活性上升[16-17]。

当环境中的生态因子发生改变时，将导致鱼体产生一系列的鱼体应激反应，这包括其体内的活性氧自由基的产生远大于消耗，从而导致机体受到不同程度的损伤[26]。CAT、SOD、GSH-Px是机体进行氧化代谢的重要酶类，在其共同作用下，使自由基的产生和清除达到动态平衡，减少机体氧化损伤，是机体内重要的保护酶系统[26-27]。在本研究中，无论是10 mg/L还是50 mg/L 的氨氮质量浓度胁迫下，杂交鲟幼鱼的CAT、SOD、GSH-Px均显著高于对照组，分析这种短时间内的升高变化可能与毒性兴奋效应有关，机体内鱼体代谢平衡受到干扰，进而启动抗氧化防御及一系列修复机制[19]。胁迫6～48 h后，CAT、SOD、GSH-Px酶活性均不同程度降低，可能是随着氨氮胁迫时间的延长，杂交鲟体内的活性氧自由基已超出抗氧化系统调节范围，与青鱼与大菱鲆的研究报道一致[16,19]。MDA是脂质过氧化的终产物之一，是生物体内自由基的指示物，常常作为各种氧自由基损伤机体的指标。本研究中，血清MDA含量在胁迫12 h时显著升高，解除氨氮胁迫恢复48 h后，高、低质量浓度组的MDA含量均不同程度高于胁迫发生前，说明机体循环代谢受到的损伤依然存在。

炎症反应可以反映组织受损伤的程度，并促进组织修复[28-29]。TNF-α是主要的促炎症细胞因子之一，能够刺激促炎症细胞因子如IL-1β等的释放，增强它们的生物效应，并为体内的炎症和细胞损伤程度提供关键指标[30]。河豚(Takifuguobscurus)鳃炎症因子TNF-α基因和IL-1β基因在氨氮胁迫下诱导表达[31]。本研究中，高、低质量浓度组胁迫6 h后，杂交鲟幼鱼鳃丝IL-1β基因和TNF基因的相对表达量均显著上调，与翘嘴鳜幼鱼的研究结果类似[7]，分析这种短时间内的升高变化应与毒性兴奋效应有关，在启动抗氧化防御及一系列修复机制的同时，上调炎症反应相关基因表达[19]；而大弹涂鱼在8.99 mg/L质量浓度下胁迫6 h时，TNF基因相对表达量显著降低[6]，这与鱼品种的耐受性相关，大弹涂鱼的氨氮耐受力低于施氏鲟、中华鲟(A.sinensis)和翘嘴鳜等[5]。解除氨氮胁迫恢复48 h后，低质量浓度组和高质量浓度组的杂交鲟幼鱼鳃丝内的TNF-α基因和IL-1β基因表达量显著下调，但是高质量浓度组没有恢复到正常水平，说明高质量浓度的氨氮胁迫能抑制和炎症反应有关酶的活性以及基因表达的水平，短暂恢复后不能恢复到健康的水平，这与鳃部组织切片观察的结果一致。在养殖中，要避免长时间高质量浓度胁迫对养殖对象的影响，还要注意养殖生态系统中的氨化等因素对氨氮含量的影响[32]。