吴 昱，张占峰，郝书航，汪国基，底 妍，汤龙信

结直肠癌是全球发病率第三、病死率第四的恶性肿瘤，全球每年新发病例达1200万，死亡60万，是目前威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，近年来结直肠癌患者逐渐呈现年轻化趋势，手术是其重要的治疗手段[1-4]。阿片类药物是常用的麻醉用药，可以通过作用于免疫细胞、肿瘤细胞上的μ和Toll样受体发挥作用[5]。芬太尼是一种常用的阿片类药物，能够与属于G蛋白偶联受体的μ受体结合，使其活化[6-7]，关闭电压门控钙离子通道，持续抑制腺苷酸环化酶从而减少cAMP的生成[8]，通过抑制MAPK信号通路来控制包括结直肠癌在内的多种肿瘤的转移和复发[9-11]。缺氧诱导因子-1(HIF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)能促进新生血管的生长，进而为肿瘤的生长和复发提供血液和营养支持[12]。同时，VEGF还能够促进血管通透性和纤维蛋白原外渗，给新生的肿瘤组织和血管提供良好的生长条件[13]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亚基组成，其中HIF-1α是功能性亚基决定着HIF-1的转录活性，HIF-1α可以提供能量，促进肿瘤组织的生长和迁移[14]。VEGF-A是最主要的VEGF。本研究通过探讨芬太尼对结直肠癌小鼠瘤体大小以及VEGF-A和HIF-1α转录活性的影响，分析以芬太尼为代表的阿片类药物对肿瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 6～8周龄SPF级雄性BALB/C小鼠购自河北医科大学动物实验中心(动物合格证号：冀医动管字703058号)；枸橼酸芬太尼注射液购自宜昌人福药业有限责任公司(批号：81D10011)；VEGF-A(E-MSEL-M0005)、HIF-1α(E-EL-M0687c)试剂盒购自Elabscience公司；逆转录试剂盒购自日本TAKARA公司；VEGF-A(ab46154)和HIF-1α(H1alpha67)抗体购自美国Abcam公司。

1.2动物模型的建立及分组 小鼠结肠癌细胞株CT26(河北医科大学馈赠)在37 ℃、5% CO2条件下，使用含10%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基进行培养。待细胞培养到对数生长期后，用0.25%胰酶消化，待其成为单细胞悬液后，使用10%胎牛血清中和残余胰酶，然后离心，观察细胞生长情况并收集细胞制备单细胞悬液备用。选取15只6～8周龄SPF级雄性BALB/C小鼠在室温下饲养1周，在每只小鼠右前肢腋窝中部皮下注射CT26细胞1×106个，然后继续常规饲养。待肿瘤直径>1 cm后，按照随机数字表法将15只小鼠随机分为A、B、C组，每组5只。B组和C组分别给予枸橼酸芬太尼注射液10和50 μg/(kg·d)腹腔注射，A组给予等量生理盐水腹腔注射；连续给药1周后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，收集小鼠心脏血液，同时分离小鼠的瘤体组织，观察瘤体大小并用标尺测量记录。

1.3观察指标及方法

1.3.1血清VEGF-A和HIF-1α水平：处死小鼠后获取血液，然后离心取上层血清，参照VEGF-A和HIF-1α试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附试验检测各组血清VEGF-A和HIF-1α水平。

1.3.2瘤体组织VEGF-A和HIF-1α mRNA表达：应用RT-PCR法检测瘤体组织VEGF-A和HIF-1α mRNA的表达水平，以B2M为内参基因。VEGF-A[15]上游引物：5'-TCACCCCACTAATGGCACC-3'，下游引物：5'-TCCACTTCCCACCAACAGAC-3'，长度为312 bp。HIF-1α[16]上游引物：5'-TCAAAGTCGGACAGCCTCA-3'，下游引物：5'-CCCRGCAGTAGGTTTCTGCT-3'，长度为90 bp。B2M[17]上游引物：5'-CGGCCTGTATGCTATCCAGA-3'，下游引物：5'-GGGTGAATTCAGTGTGAGCC-3'。取各组瘤体组织1 g剪碎，置于2 ml离心管，加入Trizol裂解液500 μl后置于冰上，使用电动匀浆器匀浆至无肉眼可见团块。将100 μl氯仿加入含瘤体组织匀浆液的离心管中，充分混匀后于冰上静置15 min，在4 ℃条件下，以12 000 r/min离心10 min。吸取上层的澄清透明液体200 μl置于新的1.5 ml离心管中，并加入异丙醇200 μl震荡混匀后在冰上静置15 min，在4 ℃条件下，以12 000 r/min离心10 min，弃上清，并加入75%乙醇500 μl，洗涤提取的mRNA。在4 ℃条件下，以12 000 r/min离心10 min，后加入200 μl DEPC水，混匀后得到总mRNA。使用逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)将mRNA逆转录为cDNA，根据其说明书配置10 μl反应体系，设置反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ forever，得到cDNA。根据RT-PCR试剂盒说明书配置反应体系后进行RT-PCR反应，用于PCR扩增。设置反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。以B2M为内参照，记录Ct值，应用2-ΔΔCt法对各目标基因mRNA的表达进行定量分析。

1.3.3瘤体组织VEGF-A和HIF-1α蛋白表达：采用Western blot法检测瘤体组织VEGF-A和HIF-1α蛋白表达水平。取各组瘤体组织1 g，按300∶1的比例加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，裂解组织并提取瘤体组织的总蛋白，用BCA定量的方法测定蛋白含量并计算，使每个样本中总蛋白含量相同。然后加入蛋白上样缓冲液混匀后水浴变性10 min。配置并使用10%的SDS-PAGE凝胶电泳，于60 V电压下电泳90 min后转至PVDF膜80 min，用5%的脱脂奶粉封闭1 h，分别加入VEGF-A和HIF-1α一抗常温孵育2 h后，在4 ℃条件下过夜。用TBST清洗后加入二抗常温孵育2 h。最后，通过增强化学发光试剂盒(Pierce, Rockford, IL, USA)进行显影。使用Image J 1.47v(Rawak Software, Inc. Germany)软件分析目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1肿瘤直径和体积比较 B组和C组肿瘤直径和体积均明显小于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，但B组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同剂量芬太尼处理结直肠癌小鼠3组肿瘤直径和体积比较

2.2血清VEGF-A和HIF-1α水平比较 B组和C组血清VEGF-A和HIF-1α水平均明显低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，但B组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同剂量芬太尼处理结直肠癌小鼠3组血清VEGF-A和HIF-1α水平比较

2.3瘤体组织VEGF-A和HIF-1α mRNA表达情况比较 B组和C组瘤体组织VEGF-A和HIF-1 α mRNA表达水平均明显低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)，但B组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同剂量芬太尼处理结直肠癌小鼠3组瘤体组织VEGF-A和HIF-1α mRNA表达情况比较

2.4瘤体组织VEGF-A和HIF-1α蛋白表达情况比较 B组和C组瘤体组织VEGF-A和HIF-1α蛋白表达水平均明显低于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。C组瘤体组织VEGF-A蛋白表达水平低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)；但C组HIF-1α蛋白表达水平与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4和图1。

表4 不同剂量芬太尼处理结直肠癌小鼠3组瘤体组织VEGF-A和HIF-1α蛋白表达情况比较

图1 不同剂量芬太尼处理结直肠癌小鼠3组瘤体组织VEGF-A和HIF-1α蛋白表达情况

3 讨论

本研究采用间断腹腔注射芬太尼的方法，观察不同剂量芬太尼对结直肠癌模型小鼠瘤体大小及VEGF-A、HIF-1α的影响，更为接近晚期结直肠癌患者的临床情况，有比较好的临床参考价值。

小鼠结肠癌细胞株CT26常用于建立小鼠结直肠癌的动物肿瘤模型[18]。在临床实践中，芬太尼的常用剂量是2～8 μg/(kg·d)，小鼠的用药量为人类的25～50倍[19]，故本研究用药剂量为10和50 μg/(kg·d)。HIF-1α、VEGF-A能够促进肿瘤组织内血管的新生，从而促进肿瘤的生长和转移。有研究显示，当沉默HIF-1α后，直肠癌SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱[20]。HIF-1α过度表达后结肠癌HCTT116细胞的迁移和侵袭能力明显增强，而敲减HIF-1α后观察到HCTT116细胞的迁移和侵袭能力明显减弱[21]。同时有研究发现，结直肠癌组织中VEGF表达明显增高，VEGF的高表达与肿瘤分化程度、肿瘤大小和Duke分期有关，可作为预测结直肠癌患者预后的潜在分子标志物[22]。

阿片类药物可以通过阿片受体活化和Toll样受体4通路激活MAPK(ERK 1/2)信号通路，Toll样受体4通路已经被证实具有抗肿瘤转移的作用[23]。有研究表明，吗啡的代谢物3-葡萄糖醛酸吗啡能激活Toll样受体4，因此阿片类药物被证明具有抗肿瘤生长特性[24]。阿片类药物可以通过c-Jun N末端激酶(JNK)来激活MAPK/ERK/JNK信号通路，抑制PI3K/Akt信号通路从而下调HIF-1α[25]。VEGF能够通过激活RhoA/Rho，促进肿瘤细胞的迁移，而阿片类药物通过作用于MAPK/ERK/JNK信号通路，从而抑制RhoA/Rho，降低肿瘤细胞的迁移能力[26-27]。另外，吗啡也能抑制VEGF的合成[28]。有研究发现，芬太尼也可以通过调控MAPK和PI3K/Akt信号通路抑制基质金属蛋白酶-9表达，从而抑制胃癌的进展[29]。

本研究结果显示，10或50 μg/(kg·d)芬太尼均能够明显抑制结直肠癌小鼠肿瘤的生长，降低血清VEGF-A、HIF-1α水平以及瘤体组织VEGF-A、HIF-1α mRNA和蛋白表达水平，且50 μg/(kg·d)芬太尼对瘤体组织VEGF-A蛋白表达的抑制作用更好，但是对于其他检测指标未发现10 μg/(kg·d)与50 μg/(kg·d)芬太尼比较具有差异。本文推测芬太尼可能是通过VEGF-A和HIF-1α抑制瘤体内新生血管的生成，从而间接抑制肿瘤的生长，而这种抑制作用可能与芬太尼剂量相关。

本研究还存在一些不足，如芬太尼对VEGF-A和HIF-1α上下游相关通路的作用没有进行验证，未用阿片受体的特异性拮抗剂来进行反向验证，也未使用VEGF-A和HIF-1α基因敲除鼠进行对照，故还需要更多的证据来证明芬太尼与VEGF-A和HIF-1α之间的作用机制。

综上所述，芬太尼能够抑制结直肠癌小鼠肿瘤的生长，这种抑制作用可能是通过下调VEGF-A和HIF-1 α实现的，而且该作用可能与芬太尼的剂量相关。