刘 顿， 吕月玲， 骆 汉

(1.西北农林科技大学水土保持研究所， 陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学资源环境学院， 陕西 杨凌 712100)

纳米材料一般指结构单元尺寸为1～100 nm的材料，由于其具有一系列新的不同于宏观物质的小尺寸效应、界面效应、量子效应等，是材料科学研究的热点[1]。纳米材料氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)是石墨烯的衍生物，是单层碳原子以sp2杂化方式形成的二维结构。与石墨烯不同的是，氧化石墨烯表面含有大量羟基、羧基等含氧基团，使得GO比石墨烯具有更大的比表面积和易修饰性。更为重要的是，氧化石墨烯的细胞亲和性优于石墨烯，从而在医学领域使用更为广泛[5]。但是，随着越来越多氧化石墨烯被应用生活，氧化石墨烯对生物造成的影响引起了学者的广泛关注，一些针对氧化石墨烯对植物生长影响的研究已经开展。李婷等[6]用25～100 mg/kg氧化石墨烯处理油菜，发现油菜根长缩短，经过50～100 mg/kg氧化石墨烯处理的油菜鲜根重显著下降。但氧化石墨烯对种子萌发和幼苗生长有促进作用。

王伟等[7]研究指出，经过低浓度氧化石墨烯处理的紫花苜蓿种子，相比于对照组种子萌发指数显著提高。王晓静等[8]认为，经过20%氧化石墨烯处理的高羊茅种子，其萌发率、萌发势、萌发指数分别提高了6.3%、20.7%、31.6%；株高、地上干重显著高于对照组。因此，氧化石墨烯对植物种子萌发和幼苗生长的影响仍不明确，有待进一步探讨。

紫穗槐是豆科落叶灌木，高1～4 m，枝褐色，叶互生，原产于美国东部，引入我国后，中国东北、西北、华北地区均有种植。紫穗槐耐贫瘠，耐水湿和轻度盐碱土，叶量大且营养丰富，含大量粗蛋白、维生素等，是营养丰富的饲料植物。此外紫穗槐郁闭度高，根系发达，侧根较多，能截留大量降雨、固结土体，减少水土流失，在水土保持林草措施中被广泛应用。

为了进一步明确氧化石墨烯对种子萌发和幼苗生长的影响，本试验以紫穗槐作为研究对象，对比经过不同浓度氧化石墨烯溶液处理种子后紫穗槐种子萌发和幼苗生长状况，探究氧化石墨烯对紫穗槐生长的影响，旨在揭示植物对纳米材料的响应以及可能存在的其他风险，为纳米材料的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

氧化石墨烯为黑色粉末，平均厚度3.4～7 nm，片层直径10～50 μm，层数5～10层，比表面积100～300 m2/g，纯度>90%。供试种子为经过挑选的籽粒饱满的紫穗槐(AmorphafruticosaLinn.)种子，千粒重12 g。玻璃培养皿口径为12 cm。芽苗移植后的生长基质是经过过筛(1 mm)、消毒的河沙。

1.2 试验方法

选择紫穗槐种子1 000粒，放入配置好的3%H2O2溶液中浸泡48 h消毒，然后在流动的无菌水下冲洗3次，阴干后将种子均分为6组放入蒸馏水冲洗过的干净培养皿中，加入配置好的浓度分别为0、50、100、150、200、250 mg/L氧化石墨烯溶液，浸泡48 h。

另外准备6组蒸馏水冲洗干净的培养皿，每组3个共18个。在培养皿中先铺一层脱脂棉，上面再铺一层滤纸，加水使滤纸和脱脂棉充分湿润，作为发芽床。待种子在氧化石墨烯溶液中浸泡完毕后，从每组浓度处理的种子中挑选大小一致，长势均匀的150粒种子，均分为3组并分别放置于培养皿发芽床上。将所有的培养皿放入光照强度为2 000 lx，温度26 ℃的培养箱中培养10 d，观察记录种子发芽个数。

再准备6个干净培养皿作为幼苗生长试验培养皿，对采集回来的河沙过1 mm筛，然后用托盘将所有过筛河沙装入80 ℃烘箱中消毒5 h，将消毒完毕的河沙装入培养皿中至培养皿深度的2/3处，用喷壶喷洒蒸馏水至湿润。发芽试验完成后，从每个浓度处理组的3个发芽床中选择20株长势均匀的芽苗移栽入新的培养皿中。移栽时先用牙签在培养基质上扎个小穴，然后把芽苗幼根轻轻放入穴内，再用湿沙将幼根埋好，并用手轻轻按压，使幼根和基质紧密接触即可，每个新的培养皿中移栽20株。培养完毕后，观察并测定各浓度处理下幼苗的苗高、地径、生物量、根长和根系表面积。

1.3 测定指标

1.3.1种子萌发指标测定

本试验测定的种子萌发指标包括发芽势(GE)、发芽率(GP)和萌发指数(GI)。

发芽势指在发芽过程中日发芽种子数达到高峰时，发芽的种子数占供测样品种子数的百分率，一般以发芽试验规定期限的最初1/3期间内的种子发芽数占供试种子数的百分比为标准。

GE(%)=(N1/N)×100% (1)

式中，N1代表从发芽试验开始到第3天的发芽数；N代表供试种子总数。

发芽率指测试种子发芽数占测试种子总数的百分比，是检测种子质量的重要指标之一。

GP(%)=(N2/N)×100% (2)

式中，N2表示到发芽试验结束时正常发芽的种子数；N表示供试种子总数。

萌发指数是发芽终期内每天发芽粒数除以对应天数的总和，用以表征种子活力，发芽指数越高，种子活力越高。

GI=∑Gt/Dt(3)

式中，Gt为时间t天时的发芽种子总数数值；Dt为萌发实验天数。

1.3.2幼苗生长指标测定

种子萌发试验结束后，移栽入新的装有消毒河沙的培养皿中培养20 d，培养完毕后每盆随机选取3株长势中等，大小均匀一致的幼苗，测量其平均株高。将所选幼苗取出，在流动的蒸馏水下冲洗干净后，80 ℃烘干至恒重，测量幼苗干重和地径。随后刈割，将根系放入WinRHIZO-2013 e根系分析仪中测量根长和根系表面积。

1.4 数据处理

用SPSS 22软件进行单因素方差分析，用Origin 2018软件进行绘图。

对紫穗槐种子萌发和生长效应评价采用隶属函数法。隶属函数是模糊集合的数学工具，表示元素属于某模糊集合的真实程度，在本文中用来表示氧化石墨烯对紫穗槐各项生长指标的具体效果，计算公式如下：

式中，R(Xj)为隶属函数值，Xj为第j个综合指标(j=1,2,3…)，Xmax、Xmin分别为第j个指标的最大值和最小值。然后用各个指标的隶属函数值相加和来计算综合评定值，计算公式如下：

R(X)=∑R(Xj) (5)

式中，R(X)为各个浓度综合评定值，R(Xj)为每个浓度下各个指标的隶属函数值。

2 结果与分析

2.1 氧化石墨烯对紫穗槐种子萌发的影响

如表1所示，随着氧化石墨烯溶液浓度升高，紫穗槐种子的发芽势总体呈先上升后下降的趋势。当使用50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L氧化石墨烯溶液处理种子时，紫穗槐种子的发芽势为16.67%、28.00%、47.33%，均高于对照组种子萌发势；当氧化石墨烯溶液浓度继续增大时，紫穗槐种子的发芽势随着溶液浓度的升高而持续降低。在所有处理组中，当氧化石墨烯溶液浓度在50～200 mg/L范围内时，紫穗槐种子发芽率均显著高于对照组；当氧化石墨烯溶液浓度为250 mg/L时，经处理的紫穗槐种子发芽势为6.00%，低于对照组但并不显著。通过对以上数据的分析，低浓度氧化石墨烯溶液(0～200 mg/L)对紫穗槐种子的萌发有显著促进作用，但浓度继续增大时，紫穗槐种子的发芽势情况需要进一步研究。针对紫穗槐种子发芽率来说，当氧化石墨烯浓度在50～150 mg/L时，经过处理的紫穗槐种子发芽率是84.00%、92.00%、93.33%，高于对照组70%的发芽率，且差异显著；当氧化石墨烯溶液浓度为200 mg/L，处理种子的发芽率为70%，与对照组相等；继续增大到250 mg/L时，种子发芽率为52.67%，显著低于对照组。结果表明，氧化石墨烯溶液浓度在50～150 mg/L范围内，对紫穗槐种子的发芽率有显著促进作用，当浓度大于200 mg/L时，对发芽率抑制效果明显。

表1 氧化石墨烯对紫穗槐种子萌发的影响

紫穗槐种子萌发指数的情况与发芽势大致相同，对照组的萌发指数为17.56%，当氧化石墨烯溶液浓度以50 mg/L增加到200 mg/L时，紫穗槐种子萌发指数分别是27.71%、42.93%、52.16%、23.11%，均显著高于对照组；当继续增大到250 mg/L时，种子萌发指数为15.45%，略小于对照组的17.56%，但没有显著变化。

在3个种子萌发指标均呈先增加后减小的变化趋势。在浓度为150 mg/L时，各个指标达到最大值，分别为47.33%、93.33%和52.16%；当氧化石墨烯浓度继续增大，发芽势、发芽率和萌发指数均逐渐减小。氧化石墨烯溶液浓度增加至250 mg/L时，种子发芽势和萌发指数下降至与对照组无显著差异(p<0.05)，而发芽率则显著低于对照组。综合以上结论，氧化石墨烯溶液对紫穗槐种子的影响可以概括为：低浓度时对紫穗槐种子萌发有促进作用，随着浓度的逐渐增大，促进作用越来越不明显，最后逐渐抑制种子萌发。

2.2 氧化石墨烯对紫穗槐幼苗株高、地径和干重的影响

经过100 mg/L、150 mg/L氧化石墨烯溶液处理过的紫穗槐幼苗的地径分别为2.54 mm、2.20 mm，均高于对照组的幼苗地径1.48 mm，并且差异显著(图1)；其余处理组的幼苗地径与对照组差异不明显，根据本实验所得结果，氧化石墨烯溶液在100～150 mg/L浓度范围内可以促进紫穗槐幼苗地径的增长，随着浓度的增加抑制效果并不明显。

注：同列不同字母表示在0.05水平上差异显著。下同。

对于紫穗槐幼苗干重来说，当氧化石墨烯浓度是50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L时，经过处理的幼苗干重分别是0.363 g、0.539 g、0.407 g，均显著高于对照组幼苗干重(0.311 g)，这说明氧化石墨烯溶液浓度在50～150 mg/L之间时，氧化石墨烯可以促进紫穗槐幼苗干重增加；当氧化石墨烯溶液浓度为200 mg/L时，经处理幼苗干重为0.294 g、与对照组差异不明显；当氧化石墨烯溶液浓度继续增大到250 mg/L时，经处理的紫穗槐幼苗干重为0.223 g，相比对照组显著下降。

紫穗槐幼苗苗高随氧化石墨烯溶液浓度增加而发生变化的情况与地径基本一致，经过50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L处理的紫穗槐幼苗苗高显著高于对照组，分别是5.19 cm、6.23 cm、5.17 cm；当溶液浓度进一步增大为200 mg/L、250 mg/L时，幼苗苗高分别为4.33 cm、3.61 cm，与对照组无显著差异。结果表明，用浓度为50～100 mg/L的氧化石墨烯溶液处理紫穗槐种子，种子发育成幼苗的苗高会有显著增加。

幼苗的苗高、干重、地径均随着氧化石墨烯浓度的增加呈先上升后下降的趋势(图2)。在氧化石墨烯浓度为100 mg/L时达到峰值，分别为6.23 cm、5.39 cm、2.54 cm，比对照组分别提高了50.48%、73.31%和71.62%。经过50 mg/L、100 mg/L和150 mg/L氧化石墨烯处理过的幼苗苗高、干重、地径均显著大于对照组(p<0.05)；当氧化石墨烯浓度>150 mg/L时，幼苗的苗高、干重、地径减小，与对照组差异不大(p>0.05)。其中当氧化石墨烯浓度为250 mg/L时，幼苗干重显著低于对照组(p<0.05)。

2.3 氧化石墨烯对紫穗槐幼苗根长、根系表面积的影响

由表2可以看出，根长和根系表面积均随氧化石墨烯浓度的增加呈先增加后减小的变化趋势，均在浓度为100 mg/L时达到最大，分别为37.73 cm、3.59 cm。当氧化石墨烯浓度大于100 mg/L时，其对根长的促生长作用逐渐减小，200 mg/L浓度时根长已降至与对照组相似(p>0.05)。而当浓度达到250mg/L时，氧化石墨烯表现出对根系生长的抑制作用，根长比对照组减小了6.2%(p<0.05)。对于根系表面积，氧化石墨烯浓度在200 mg/L时体现出抑制作用，当浓度达到250 mg/L时，根系表面积比对照组减小了11.0%。氧化石墨烯处理有明显的低浓度促进生长，高浓度抑制生长的现象。

表2 氧化石墨烯对紫穗槐根系生长的影响

2.4 氧化石墨烯对紫穗槐种子萌发及幼苗生长影响的评定

采用隶属函数法就氧化石墨烯溶液对紫穗槐种子萌发和幼苗生长的影响进行评定。最终0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L氧化石墨烯溶液所得分数分别为1.88、4.02、7.25、6.02、2.25、0，氧化石墨烯的影响排序为100 mg/L>150 mg/L>50 mg/L>200 mg/L>250 mg/L(表3)。100 mg/L氧化石墨烯溶液对紫穗槐种子萌发和幼苗生长促进效果最明显，并且浓度范围在50～200 mg/L时均有促进作用，当浓度增大到250 mg/L时，对紫穗槐种子萌发和幼苗生长会有抑制作用。

表3 隶属函数分析

3 讨 论

种子发芽势、发芽率和萌发指数都具有随着氧化石墨烯浓度增加，指标数值呈先增大后减小的趋势(表1)，均在150 mg/L时达到峰值。氧化石墨烯浓度在50～200 mg/L范围内时，有明显的促进作用。这与Zhang等[9]针对石墨烯对番茄种子萌发和幼苗生长情况的研究结果相一致，石墨烯可以破坏种子表皮，加快种胚吸水，从而使其发芽速度加快。氧化石墨烯与石墨烯具有同样锋利的片层，可以破坏紫穗槐种子表皮的鞣质，加快紫穗槐种子的吸水，从而提高紫穗槐种子发芽率、发芽势和发芽指数。

氧化石墨烯也可以显著增加紫穗槐幼苗苗高、地径和干重，并且出现低浓度氧化石墨烯促进生长，高浓度抑制生长的现象，指标数值呈先增加后降低的现象(图2)，这与其他学者研究结果一致。经过纳米材料处理的大豆、水稻、小麦、苜蓿和黄瓜均存在这一现象[10-13]，产生这种现象的原因是纳米材料暴露可以诱导植物细胞中活性氧化簇的产生，进而引起一系列植物防御反应，这些防御反应主要表现为丙二醛含量升高，抗氧化酶活性改变，叶绿素水平降低和氧化应激损伤等现象[14-17]。当氧化石墨烯浓度超过某一阈值时，氧化胁迫加剧，对紫穗槐种子细胞造成不可逆的损伤，从而对以后的生长造成负面影响。

本试验中，氧化石墨烯是通过浸泡种子的方式作用于植物，没有直接接触植物根系，对于经过处理的种子发育成幼苗后依然出现低浓度促进生长，高浓度抑制生长这一现象的原因，可能与种子细胞内的生长素有关。氧化石墨烯促进植物生长的机制是其通过调控生长素和脱落酸的合成来影响植物的生长[18-21]。本试验初期用氧化石墨烯溶液浸种时，渗透进紫穗槐种子内部的氧化石墨烯分子引起种子中植物激素的有机酸的含量变化，从而影响根系生长。

4 结 论

氧化石墨烯溶液浓度在50～200 mg/L之间对紫穗槐种子萌发和幼苗生长均起到促进作用，且低浓度溶液的促进作用更加显著。随着浓度的增高，促进作用越来越弱，直至抑制生长。隶属函数分析结果表明，种子萌发最适宜的浓度为150 mg/L，幼苗生长最适浓度为100 mg/L。综合比较隶属函数值R(100mg/L)>R(150 mg/L)后认为，紫穗槐种子萌发及幼苗生长最适浓度为100 mg/L。