李晶铃，阴赪宏

内毒素血症是由于病原菌释放大量内毒素至血液而引起的，以多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)为主要病理特征的一系列综合征[1-2]。肝脏是人体内最大的解毒器官，也是内毒素代谢的主要场所，极易受到内毒素攻击，这也是内毒素血症常常并发肝功能障碍的主要原因[3]。既往研究[4-5]表明，肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在脓毒症导致的器官损伤中介导重要机制。在脓毒症动物模型中，有学者发现肝脏亦存在着局部RAS系统，该系统以血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)为主要效应分子，通过与肝细胞膜的血管紧张素1型受体(angiotensin type 1 receptor, AT1R)结合而增加血管紧张素原的转录与翻译，从而形成自身反馈机制，引起恶性循环和不断放大的炎性级联反应[6]。该研究重点分析肝损伤和RAS表达的相关性，以进一步明确其病理机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康清洁级(specific pathogen free, SPF)Wistar大鼠90只， 6～8周龄，体质量250～280 g，购自中国医学科学院实验动物中心(动物合格证号：44007200004126，许可证号：SCXK(京)2018-0005)。本研究方案经北京友谊医院动物伦理委员会审批(批号：TUH18260001)，符合实验室动物管理与使用准则。

1.2 试剂与仪器智能放免测量仪(上海原子能研究所日环仪器厂)；小型垂直电泳与电转印装置(美国Bio-Rad公司)；高速低温离心机(美国SIGMA 公司)；一氧化氮(nitric oxide, NO)化学法试剂盒、内皮素(endothelin, ET)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme Ⅱ, ACE Ⅱ)试剂盒购自海军总医院；血管紧张素Ⅰ(Angiotensin Ⅰ, Ang Ⅰ)、Ang Ⅱ、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素(IL)-10试剂盒购自北京市福瑞生物工程公司；AT1R及内参引物购自美国Santa Cruz公司；脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)购自美国Sigma公司。

1.3 模型制备与取样方法所有大鼠，适应性饲养一周，随机分为9组，对照组10只和模型组8个亚组(注射后2、4、8、12、24、48、72 h和7 d共8个时间点)，模型组腹腔注射10 mg/kg LPS，对照组注射等体积无热原水。对照组于注射后8 h取样，模型组各个亚组以注射时为0点计时，分别于注射后2、4、8、12、24、48、72 h及7 d时取样，1%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，取心脏血，室温静置2 h，3 000 r/min离心取血清，-20 ℃存储。之后摘取肝脏，并分两种样本保存，一种制备为石蜡切片样本，另一种液氮保存。

1.4 血清学指标检测所得血清，采用内毒素测定仪测定内毒素水平；采用硝酸还原酶法测定NO水平；采用全自动放射免疫分析仪和ELISA试剂盒测定NOS、TNF-α、IL-10的血清水平，以及肝功能标志物ALT、AST、LDH的血清水平。

1.5 肝脏组织HE染色与病理评分随机抽取大鼠1只/组，取肝脏组织，制备病理切片，HE染色，显微镜下观察肝脏病理评分。评分标准：0分：肝组织结构正常，细胞排列规则，无坏死和炎性浸润；1分：肝细胞点状坏死，存在散在的炎性浸润和嗜酸小体；2分：肝细胞片状或灶状坏死，但坏死范围在小叶1/3内；3分：肝细胞广泛坏死，占小叶1/3～2/3；4分：肝细胞广泛坏死，超过小叶2/3。

1.6 组织学指标检测所得肝脏组织，分为两部分，一部分采用ELISA实验测定ACE、Ang Ⅱ、AT1R水平；另一部分采用RT-qPCR实验测定AT1R mRNA表达。RT-qPCR实验的主要步骤：采用TRIzol总RNA抽提试剂盒提取组织的总RNA，所得RNA以DEPC水配置为1 μg/μl的溶液。采用核酸蛋白仪测定A260/A280的相对吸光度，1.8～2.2之间的为纯净度良好。再取2 μl RNA溶液，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，90 V电泳30 min，采用凝胶成像分析系统观察18S和28S的条带亮度，条带清晰且28S/18S≥2为完整度良好。将合格产品纳入反转录实验，PCR仪中操作，常规反转录体系和条件生成cDNA。进行PCR扩增实验，AT1R引物上游序列：5′-GGC GCG GGT TTG ATA TTT GAC A-3′，下游序列：3′-CAA AGG GCC AGC GGT ATT CCA TAG-5′。扩增条件：预变性，95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 个循环。反应结束后确认扩增曲线和融合曲线，以2-ΔΔCt法计算表达量。

2 结果

2.1 血清应激和炎性介质的比较模型组大鼠循环LPS在注射后迅速升高，于2 h时达峰，7 d时降至正常水平，中间时间段均高于对照组(P<0.05)。TNF-α和IL-10在注射后也迅速升高，于2 h时达峰；TNF-α和IL-10分别在8、12 h时降至正常水平，中间时间段均高于对照组(P<0.05)。NO与NOS在注射后逐渐升高，12 h时达峰；NO在4～48 h时高于对照组，NOS在2～48 h时高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠应激和炎性介质水平变化

2.2 肝脏病理观察对照组在注射前、注射后48 h和7 d三个时间点，肝脏形态正常，细胞排列整齐，肝组织病理评分基本为0，均无肝细胞变性及坏死现象；模型组注射前，大鼠肝脏形态正常，细胞排列整齐，注射后2 h和4 h时，也未发现明显病理改变，注射后48 h，细胞出现变形和坏死，胞核增大，炎性细胞灶状浸润，评分为(1.5±0.5)分；注射后7 d，细胞广泛坏死，炎性细胞广泛浸润，评分为(3.3±0.6)分。见图1。

图1 两组大鼠各个时间点肝脏病理HE染色后观察 ×200A:对照组；B:注射后2 h；C:注射后4 h；D:注射后8 h；E: 注射后48 h；F:注射后7 d

2.3 肝功能标志物的比较模型组大鼠的循环AST、ALT及LDH水平在LPS注射后即逐渐升高，8 h时达峰；AST与LDH在4～48 h时均高于对照组，ALT在2～72 h时均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肝功能标志物的比较

2.4 循环RAS水平的比较模型组大鼠的循环PRA在注射后2 h显著升高，之后逐渐降低，在48 h内的水平均高于对照组(P<0.05)。ACE和Ang Ⅱ在注射后也呈现出先增后减的变化趋势，ACE在2～24 h时，Ang Ⅱ在2～48 h时均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠循环RAS水平比较

2.5 肝组织RAS水平的比较模型组大鼠肝脏PRA在注射后2 h显著升高，之后逐渐降低，在48 h内的水平均高于对照组(P<0.05)。ACE、Ang Ⅱ、AT1R水平也呈现出先增后减的趋势；ACE在2～24 h，Ang Ⅱ在2～48 h，AT1R在4～48 h时高于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠肝脏RAS水平比较

3 讨论

内毒素血症是一组由血液中内毒素积聚而引发的全身炎症反应综合征，极易引发多器官功能障碍综合征，RAS过度激活是内毒素血症导致多器官功能障碍的重要机制之一[7]。本研究在前期也已证实LPS诱导的内毒素血症中，肾脏损伤、心脏损伤均伴随有RAS的参与。肝脏亦存在着局部RAS，以Ang Ⅱ为主要效应分子，通过与肝细胞膜上面的AT1R结合增强血管紧张素原表达，进一步促进ACE合成和Ang Ⅰ、Ang Ⅱ的产生，形成一种肝脏内部的自身反馈机制，在包括肝纤维化、脂肪肝、病毒性肝炎、肝癌、化疗所致肝损伤等多种肝脏疾病中发挥了重要作用[8-10]。然而，关于肝脏系统中RAS是否参与了内毒素血症所致肝功能损伤，目前报道较为少见。

本研究表明，模型组大鼠在LPS注射后，应激和炎性介质成数十倍增长，这与其他学者的报道[11]结果基本一致。既往研究[12]指出，LPS进入循环系统后被多种免疫细胞俘获并发生免疫应答，其中巨噬细胞活化后可产生大量炎性因子，包括TNF-α、IL-6和IL-10等，其中TNF-α和IL-6还是凋亡信号通路的重要介质，NF-κB/TNF-α和IL-6/STAT3等信号的激活可进一步促进细胞凋亡与组织损伤。在内毒素血症中，炎性损伤与氧化应激相辅相成，共同参与组织破坏，TNF-α积聚后可促进中性粒细胞脱颗粒释放氧自由基，诱发与加重氧化应激损伤，而氧化应激产生的大量中间产物如白三烯、血栓素A2等都是强效促炎介质，可促进炎性因子的产生，从而形成瀑布级联反应[13]。因此应激和炎性介质的升高证实内毒素血症模型制备相对成功。

肝脏病理观察结果显示模型组大鼠在注射后48 h，肝脏组织有较为严重的损伤，且注射结束后的7 d损伤程度并未见恢复，这说明内毒素血症引发的肝脏损伤可能是不完全可逆的。本研究显示模型组大鼠在LPS注射后肝功能标志物均有较大幅度的升高，注射后4～48 h之间的水平均高于对照组。有研究指出，作为代谢和解毒的主要场所，肝脏也是内毒素血症最易受累的器官之一，为分析肝脏内部的RAS变化，本研究进一步测定了循环系统和肝组织的PRA、ACE、Ang Ⅱ及AT1R。在RAS中，Ang Ⅰ来源于血管紧张素原，并进一步在ACE的催化作用下形成Ang Ⅱ，Ang Ⅱ是该系统的主要效应分子，可与受体结合，调节血压、血管张力和水电解质的代谢等活动[14]，这也是本研究选择ACE、Ang Ⅱ、AT1R的重要原因。本研究结果显示RAS的变化趋势与肝功能损伤趋势基本一致，这说明在内毒素血症所致肝脏损伤机制中，RAS可能也是重要的参与者。

综上所述，该研究分析了内毒素血症大鼠模型发病的不同时间点肝功能损伤及局部RAS的变化，结果显示肝脏损伤过程中均伴随着局部RAS表达异常。研究认为内毒素血症所致肝损伤中可能有局部RAS的参与。