李 靖，谢 波，汪 虎，张晨嵩，贾建光，潘成武，马家驰

胃癌(gastric carcinoma, GC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率排名第五，病死率排名第三[1]。虽然手术治疗、放疗和化疗已被应用于胃癌的治疗，但胃癌患者的5年生存率仍低于30%[2]。基因重组是癌症的一个标志，可导致具有致癌特性的基因融合[3]。近年来研究[4]表明，胃癌中有CLDN18-ARHGAP26融合基因。表达CLDN18-ARHGAP26融合期的胃癌细胞系上皮表型明显减少，出现上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表型，从而对目前主要的胃癌化疗相关药物耐药。研究[5]表明，人参皂苷可以有效抑制胃癌细胞的增殖并促进胃癌细胞的凋亡，在低浓度奥沙利铂(oxaliplatin, L-OHP)细胞模型中人参皂苷可以显著提高低浓度的奥沙利铂对胃癌侧群(side population, SP)细胞的敏感性，而在耐奥沙利铂胃癌EMT模型中，人参皂苷可以有效逆转胃癌耐药细胞株EMT，从而达到抗肿瘤的效果。该研究中利用人参皂苷干预探究人参皂苷在CLDN18-ARHGAP26融合突变引起的耐化疗药过程中的抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料人胃癌细胞系BGC-823购自南京科佰生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；青链霉素混合液购美国Hyclone公司；过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的慢病毒载体由上海吉玛基因公司构建；Lipofectamine 2000转染试剂均购自美国Thermo公司；TRIzol试剂购自上海索莱宝生物科技有限公司；逆转录试剂盒和SYBR PremixEx TaqTM(Tli RNaseH Plus) 试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；E-Cadherin、Vimentin抗体均购自美国Abcam公司；RAPI裂解液和BCA法蛋白浓度检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白酶抑制剂购自美国罗氏公司；PVDF膜和ECL发光液均购自美国Millipore公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司；Hoechst33342染液购自美国Sigma公司。BD FACSMelody细胞分选仪购自美国BD公司。

1.2 细胞培养人胃癌细胞系BGC-823用含10% FBS的RPMI-1640培养基置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内培养。细胞长到70%～80%融合时，用0.25%胰酶-EDTA消化进行传代。取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 细胞分选选择生长状态良好的对数生长期的细胞用0.25%胰酶-EDTA消化，取适量细胞悬液收集细胞1 000 r/min，4 ℃，离心5 min，用含2%FBS的PBS液洗涤2次。调整细胞密度为1×106个/ml细胞，加入终浓度为5 μg/ml Hoechst33342染液放置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱箱中孵育2 h，孵育结束后，细胞用含2%FBS的PBS清洗一次终止反应。最后使用BD FACSMelody细胞分选仪进行SP和NSP细胞的检测及分选(355 nm波长紫外光激发Hoechst染色，于450 nm收集蓝光荧光信号，650 nm收集红光荧光信号)。

1.4 细胞转染取对数生长期的BGC-823NSP细胞用胰酶消化，细胞计数将细胞浓度调整为1×105个/ml，取2 ml/孔接种于6孔板中，放于培养箱中培养24 h，第二天，用含有5 μg/ml polybrene的新鲜培养基加入适量病毒悬液替换原培养基，37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养。Control组加入对照慢病毒，Lentivirus组加入过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因的慢病毒。培养12 h后，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。继续培养24 h 后进行后续实验检测步骤。

1.5 总RNA提取和qPCR将转染CLDN18-ARHGAP26融合突变基因48 h的NSP细胞培养基倒掉，用无菌PBS洗涤2次，再加入1 ml的TRIzol裂解液室温裂解5 min后转移到1.5 ml EP管中，取200 μl三氯甲烷加入裂解液中充分混匀后静置15 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上层透明的水相并加入等体积的异丙醇后混匀，室温静置10 min后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，所得到的白色沉淀即为细胞总RNA，用75%乙醇将沉淀洗2次，用适量的水将RNA溶解。用Nanodrop 2000超微量分光光度计测RNA浓度，按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA。

设计合成CLDN18-ARHGAP26引物，F：5′-TGGG TCCAACACCAAAAACAAG-3′，R：5′-GAGTCTGTTTT CCGCCGTGT-3′；ABCG2引物，F：5′-TTTACGCACAG AGCAAAGCC-3′，R：5′-GTCAGCGTGGGATCCTCTT C-3′；内参GAPDH引物，F：5′-TCAGCCGCATCTTC TTTTGC-3′，R：5′-ATGGTGTCTGAGCGATGTGG-3′。以cDNA作为模板，每组设置3个复孔，根据设计好的引物用ABI SystemStepOnePlus进行荧光实时定量反应。按照两步法扩增标准程序：95 ℃、30 s预变性；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s进行40个循环的扩增反应。反应结束后得到各孔的循环阈值(threshold cvcle，Ct)，采用2-ΔΔCt法分析各样本数据。

1.6 Western blot将转染CLDN18-ARHGAP26融合突变基因48 h的NSP细胞培养基倒掉，用无菌PBS洗涤2次，用细胞裂解液提取细胞总蛋白。分别配制分离胶和浓缩胶，蛋白电泳结束后将蛋白质电转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭，一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次8 min；二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，每次8 min。滴加适量ECL底物显色剂曝光，扫描图像，应用Image J软件分析扫描蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 CCK-8检测药物敏感性将100 μl细胞接种于96孔培养板每孔5×104个细胞，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，加入不同浓度梯度的L-OHP(0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml)培养24 h，加入10 μl CCK-8溶液，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养3 h，读取490 nm处吸光度值。计算细胞活力(%)=[A(待测孔)-A(空白孔)]/[A(对照孔)-A(空白孔)]×100%

2 结果

2.1 NSP细胞过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因后ABCG2蛋白的表达流式细胞术分选胃癌细胞系BGC-823的SP(1.3%)和NSP(98.7%)细胞(图1A)，将得到NSP用于本研究。以慢病毒为载体携带过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因于NSP细胞中，用qPCR检测CLDN18-ARHGAP26融合突变基因和ABCG2的mRNA表达，结果显示CLDN18-ARHGAP26融合突变基因的表达增加(图1B)。细胞过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因后ABCG2 mRNA的表达高于未转染细胞(图1C)。

图1 NSP细胞转染过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因的效率和ABCG2的表达A：细胞分选仪分选BGC-823细胞SP和NSP细胞；B：qPCR检测CLDN18-ARHGAP26融合突变基因；C：ABCG2的mRNA表达；Control组：转染阴性对照慢病毒；Lentivirus组：转染过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因的慢病毒；与Control组比较：***P<0.001

2.2 NSP细胞过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因后E-Cadherin、Vimentin蛋白的表达Western bolt检测EMT相关蛋白E-Cadherin、Vimentin蛋白的表达，结果显示，Control组细胞E-Cadherin蛋白表达高于Lentivirus组细胞E-Cadherin蛋白表达(t=4.372，P<0.01)，Lentivirus组细胞Vimentin蛋白表达高于Control组(t=6.674，P<0.01)。见图2。

图2 过表达CLDN18-ARHGAP26融合基因的NSP细胞发生EMTA：Western bolt检测E-Cadherin、Vimentin蛋白表达；B：统计学分析E-Cadherin、Vimentin蛋白相对表达量；与Control组比较：**P<0.01

2.3 NSP细胞过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因后对L-OHP耐药性的影响不同浓度L-OHP处理转染慢病毒的NSP细胞24 h后，用CCK-8检测其对过表达CLDN18-ARHGAP26融合基因细胞生长的抑制作用。结果显示，不同浓度L-OHP对NSP细胞增殖均有抑制作用，IC50为4.28 μg/ml。过表达CLDN18-ARHGAP26融合基因后，L-OHP对细胞增殖的抑制作用减弱，IC50为15.87 μg/ml。见图3。

图3 NSP细胞过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因后对L-OHP耐药性的影响 与Control组比较：**P<0.01

2.4 人参皂苷对过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的NSP细胞耐药性的影响为了研究人参皂苷对过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的NSP细胞耐药性的影响。先用不同浓度(0、10、30、50、100 μg/ml)人参皂苷处理NSP细胞，结果显示，50、100 μg/ml人参皂苷明显抑制NSP细胞增殖，10 μg/ml人参皂苷对NSP细胞增殖没有明显作用，因此选用30 μg/ml作为人参皂苷刺激NSP的有效浓度(图4A)。进一步检测30 μg/ml人参皂苷和不同浓度L-OHP对过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的NSP细胞活力的影响。结果显示人参皂苷和L-OHP联合用药降低了转染细胞的活力。提示人参皂苷能逆转过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因引起的对L-OHP的耐药作用。见图4B。

图4 人参皂苷对过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的NSP细胞耐药性的影响与L-OHP组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.5 人参皂苷对过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的NSP细胞EMT的逆转作用Western bolt检测人参皂苷对过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的NSP细胞EMT相关蛋白的表达。结果显示，人参皂苷处理的转染组细胞的E-Cadherin蛋白表达高于单纯转染组(t=18.063，P<0.01)，Vimentin蛋白的表达为(0.37±0.12)，低于单纯转染组(t=4.011，P<0.05)。见图5。

图5 人参皂苷对过表达CLDN18-ARHGAP26突变基因的NSP细胞EMT的逆转作用A：Western bolt检测E-Cadherin、Vimentin蛋白表达；B：统计学分析E-Cadherin、Vimentin蛋白相对表达量；1：Lentivirus组；2：Lentivirus+人参皂苷组；与Lentivirus组比较：**P<0.01

3 讨论

有研究[6]表明100个胃癌患者中有3个CLDN18(一个使细胞间紧密结合的基因)和ARHGAP26(一个编码RHOA抑制剂的基因)发生突变，融合形成了CLDN18-ARHGAP26，细胞和细胞及细胞和细胞外基质的附着力降低，表现出EMT，这种突变可能导致癌细胞转移。2018年Yang et al[7]利用高通量测序发现了CLDN18-ARHGAP26融合突变与胃印戒细胞癌临床诊断/预后指标和化疗耐药显著相关，该研究表明目前的化疗方式对肿瘤中存在该融合基因的患者效果不好。该研究利用慢病毒转染过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因，在细胞水平上探索其对肿瘤细胞耐药性和侵袭性的影响。

有研究[8]对胃癌细胞进行流式细胞分选时发现，不同分化程度的胃癌细胞株中均有少量侧群(SP)细胞，比例大约在1%～4%之间。ABCG2是与肿瘤多药耐药性密切相关的多药耐药跨膜蛋白，SP细胞表现出高表达ABCG2的特点，SP细胞ABCG2的表达比NSP细胞高3倍。而对于未分选细胞(SP+NSP)来说，ABCG2的表达并不高，但是在进行诱导耐药后ABCG2的表达明显升高[9]。该研究利用流式细胞分选仪分选出BGC-823细胞中的NSP细胞，显示NSP细胞中过表达CLDN18-ARHGAP26融合突变基因能使ABCG2表达明显升高。

EMT是指具有极性的上皮细胞丧失极性和细胞间接触等上皮细胞样表型，转化成具有迁移能力的间质细胞的过程。在肺癌细胞中，EMT的发生与肿瘤的侵袭性和耐药性有关[10]。E-Cadherin是参与细胞之间黏附连接的主要蛋白分子，主要分布于上皮细胞中，发挥着维持细胞极性和组织结构完整性的功能[11]。波形蛋白(Vimentin)是间充质细胞的主要骨架成分。因此，Vimentin常被用作EMT的细胞标记物[12]。一般情况下，E-Cadherin蛋白表达降低和Vimentin蛋白表达增加提示发生了EMT。过表达CLDN18-ARHGAP26基因的NSP细胞E-Cadherin蛋白表达显著降低，而Vimentin蛋白表达显著增加，表明细胞发生了EMT。为了研究CLDN18-ARHGAP26融合突变基因对癌细胞耐药性的影响，该研究利用化疗药L-OHP对分选的BGC-823 NSP细胞进行耐药测试。该研究用CCK-8检测细胞存活率，结果表明，与对照组相比，过表达CLDN18-ARHGAP26基因的NSP细胞对L-OHP产生了耐药。人参的主要成分是人参皂苷，人参皂苷能通过调控NF-κB、ERK、Akt信号通路等抑制癌细胞的EMT，从而抑制癌细胞的迁移和侵袭过程[13]。为探究人参皂苷干预对CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的EMT和耐药性的影响，该研究首先确定了人参皂苷对BGC-823 NSP细胞的有效作用浓度为30 μg/ml。NSP细胞转染过表达慢病毒之后给予人参皂苷和L-OHP干预，只用L-OHP的细胞存活率明显低于同时给予人参皂苷和L-OHP的细胞，提示人参皂苷能逆转CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的耐药。同时检测了两组细胞的EMT相关蛋白，结果表明，人参皂苷也能逆转CLDN18-ARHGAP26基因融合引起的EMT作用。

综上，人参皂苷干预能逆转CLDN18-ARHGAP26过表达引起的EMT和耐药，从而发挥抗肿瘤作用。该研究对肿瘤化疗药物的研究及临床转化应用有指导意义。