石伊宁，刘嘉林，刘芳芳，方浩徽，杨 进，陆友金

肺癌是全球最常见的癌症之一。大约85%的肺癌是非小细胞肺癌，15%是小细胞肺癌[1-2]。随着科学技术的发展，目前肺癌主要以化疗来控制病情的进展，但随着其高耐药性和转移率的出现，致使患者的5年生存率仍然很低[3]。这就需要探索新的治疗靶点及药物来提高患者的生存率。

神经酰胺是鞘脂代谢的核心分子，它是细胞信号转导的重要参与者，并参与细胞生长、衰老、凋亡、迁移、侵袭等生物过程[4]。有研究[5]表明神经酰胺可以激活丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，从而改变线粒体膜电位诱导细胞凋亡。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在诱导巨噬细胞发生炎症时可以通过激活酸性鞘磷脂酶从而诱导细胞内神经酰胺的产生[6]，但具体的神经酰胺的作用并不完全清楚，需进一步验证。该研究将使用外源性C2-神经酰胺作用于非小细胞肺癌细胞系，观察其诱导癌细胞凋亡后的形态及蛋白分子变化，并为临床肺癌的化疗靶点提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞培养人肺腺癌细胞系A549及PC9是由中国科学技术大学生命科学院提供，置于37 ℃、5% CO2培养箱中在含有10%胎牛血清、1%的双抗(50 U/ml青霉素和0.05 mg/ml链霉素)的高糖DMEM完全培养基中培养。待其贴壁生长后，每日更换培养基，待细胞生长至80%～90%时用胰酶消化后传代。

1.2 主要试剂与仪器C2-神经酰胺购自美国Sigma公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Anti-β-actin、anti-Caspase-3、anti-cleaved Caspase-3 抗体均购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠、山羊抗兔二抗均购自北京中杉金桥生物公司；CCK-8比色法检测试剂盒、Hoechst凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；AnnexinV-FITC细胞流式化学检测试剂盒购自上海贝博生物科技有限公司；Thermo Scientific NanoDrop分光光度计购自美国Thermo Scientific公司；TRIzol试剂购自日本TaKaRa公司；SYBR Green Master Mix Kit购自日本Takara Biotechnology公司；ECL发光显色试剂盒购自美国Thermoscientific公司。

1.3 CCK-8比色法筛选C2-神经酰胺的浓度当A549和PC9细胞处于对数生长期时，分别以3×104个/ml和2×104个/ml接种于96孔板中，每孔100 μl,于培养箱孵育24 h后，处理组分别加入不同浓度(0、10、20、50、80、100、200 μmol/L)的C2-神经酰胺，对照组加入等体积的完全培养基培养24 h，每孔加入10 μl的CCK-8，37 ℃培养箱中孵育1 h，通过酶标仪于450 nm波长下，测量每孔的吸光度值。用与对照组的百分比值来表示细胞活性，从而筛选出C2-神经酰胺的浓度。

1.4 Hoechst 33258凋亡染色法观察A549和PC9细胞凋亡取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5 min,然后用无菌的PBS洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次，将盖玻片置于6孔板内。取对数生长期的细胞接种于6孔板，待细胞密度达到50%～80%时，加入C2-神经酰胺刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5 ml固定液，固定10 min。除去固定液，置于摇床上用PBS清洗2次×3 min，去除液体，加入0.5 ml的Hoechst 33258染色液，在摇床上染色5 min。染色后去除染色液，置于摇床上用PBS洗2次×3 min，然后在盖破片上滴1滴抗荧光淬灭剂，置于载玻片上，注意避免产生气泡。置于倒置显微镜，在激发波长为350 nm、发射波长460 nm左右拍摄，凋亡细胞为细胞核致密浓染者。

1.5 流式细胞仪检测A549及PC9细胞凋亡将对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞生长至80%～90%时，加入C2-神经酰胺处理24 h后，使用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞后，制成细胞悬液。收集细胞于15 ml离心管中，离心后弃上层液，使用PBS清洗3次后弃去PBS，加入400 μl的结合缓冲液，然后加入10 μl的荧光素FITC标记的膜联蛋白V(AnnexinV-FITC)避光孵育15 min，然后加入10 μl的碘化丙啶(PI)进行避光染色5 min。然后立即用流式细胞仪检测细胞凋亡率，重复3次。

1.6 Western blot检测凋亡蛋白表达将对数生长期细胞接种于6 cm的小皿中，C2-神经酰胺处理过后，使用PBS清洗3次，加入适当的细胞裂解液，使用1.5 ml的EP管收集细胞后冰上裂解30 min，4 ℃、15 000 r/min离心15 min。收集上清液后用BCA法进行蛋白定量，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳后转移至PVDF膜上；用5%的脱脂牛奶封闭1.5 h，分别使用特异性的Caspase-3(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)孵育，在4 ℃冰箱中过夜，第2天用TBST洗涤3次×8 min，室温孵育相对应的辣根过氧化酶山羊抗体1 h，使用TBST洗涤3次×8 min后，采用高灵敏度的显影剂ECL进行发光显影。

1.7 RT-PCR检测A549及PC9细胞mRNA表达将对数生长期细胞接种于6 cm的小皿中，C2-神经酰胺处理后，使用预冷的PBS清洗3次，采用TRIzol法提取细胞总RNA，用Thermo Scientific NanoDrop仪器进行浓度定量。使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。使用实时PCR系统进行PCR反应。每个目的基因的表达是通过2-△△Ct方法统计比较RNA水平,引物序列见表1。

表1 β-actin、Caspase-3引物序列

2 结果

2.1 不同浓度C2-神经酰胺分别对A549/PC9细胞的影响不同C2-神经酰胺浓度(0、10、20、50、80、100、200 μmol/L)作用于A549细胞后，浓度在50、80、100、200 μmol/L时差异有统计学意义(F=188.4，P<0.05)；作用于PC9细胞后，浓度在20、50、80、100、200 μmol/L时差异有统计学意义(F=385.5，P<0.05)。见图1。在一定浓度范围内，细胞损伤程度逐渐增加，细胞活性逐渐下降。当C2-神经酰胺浓度在50 μmol/L时，两种细胞活力都在60%～80%，因此，选取50 μmol/L作为细胞损伤的浓度。

图1 不同浓度的C2-神经酰胺对A549/PC9细胞活力的影响与对照组(0 μmol/L)比较: *P<0.05，**P<0.01

2.2 Hoechst 33258凋亡染色及流式细胞仪检测细胞凋亡Hoechst 33258凋亡染色结果显示，与对照组相比，在两种细胞A549和PC9中C2-神经酰胺组细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(t=20.24、26.354，P<0.01),见图2；同样, 与对照组相比，使用流式化学技术检测两种细胞(A549及PC9)的凋亡率也增加(t=57.02、78.68，P<0.01),见图3。

图2 Hoechst 33258检测A549/PC9细胞凋亡 ×200与对照组比较:**P<0.01

图3 流式细胞术测定A549/PC9细胞凋亡的情况与对照组比较: **P<0.01

2.3 C2-神经酰胺诱导A549/PC9凋亡中蛋白的表达Western blot结果显示，在A549中与对照组相比，C2-神经酰胺组Caspase-3及cleaved Caspase-3表达水平上升，因此，增加C2-神经酰胺水平可以导致细胞凋亡，差异有统计学意义(t=9.873、2.908，P<0.05)，在PC9细胞中Caspase-3及cleaved Caspase-3表达水平也升高(t=4.798、4.057，P<0.05)，见图4。

图4 Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白的表达情况A: A549细胞；B: PC9细胞；与对照组比较: *P<0.05，**P<0.01

2.4 C2-神经酰胺诱导A549/PC9凋亡中Caspase-3蛋白基因水平的表达RT-PCR结果显示，在两种细胞中，与对照组相比，C2-神经酰胺组Caspase-3表达水平增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图5 Caspase-3蛋白在A549/PC9细胞中基因表达水平与对照组比较: *P<0.05, **P<0.01

3 讨论

肺癌是世界上第二大常见的癌症，病死率占所有癌症的25%。研究[7-9]表明，在过去的几十年中，肺癌的5年生存率低于20%，其中非小细胞肺癌预后很差，诊断时出现转移的患者约占50%。尽管近年来在多项随机临床试验中研究了新的化疗方案和新的细胞毒性组合，但肺癌患者的预后并未获得明显改善，非小细胞肺癌的患者的5年生存率仍约为15%。虽然目前手术是唯一可能的治疗方法，但一般患者在确诊时已丧失了最佳的手术时机，只能使用化疗或放疗的方式延缓病情的进展，延长患者生命。该实验使用非小细胞肺腺癌细胞系细胞(A549/PC9)作为研究对象，验证了鞘磷脂类物质C2-神经酰胺对其影响，为临床鞘脂类物质应用于癌症治疗提供帮助。

神经酰胺为调节细胞代谢的核心分子，在细胞膜稳定方面发挥着不可替代的作用，常被认为是调节细胞增殖、细胞周期停滞、分化和凋亡的第二信使[10]。当然，神经酰胺的活性主要取决于它的分子链的长短，短链(C2、C6、C8)和长链(C16、C18)会促进凋亡，而超长链分子的神经酰胺(C24)无相同作用。实验[11]表明C2-神经酰胺可促使头颈部鳞状细胞癌细胞发生保护性自噬，以抑制神经胶质瘤浸润[12]；同样C8-神经酰胺可降低肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)的活力并诱导细胞凋亡[13]。尽管神经酰胺在糖尿病、阿尔茨海默病、抑郁症、多发性硬化症及乳腺癌等病理变化中的调节作用已经报道，但对非小细胞肺腺癌细胞的研究还很少。该研究表明非小细胞肺癌细胞(A549及PC9)的细胞活性可随C2-神经酰胺浓度的增加而呈下降的趋势。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族成员，又称细胞凋亡因子, 它能通过多种途径促进细胞的凋亡，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的最直接的效应因子。与对照组相比，神经酰胺还能使凋亡蛋白Caspase-3的表达升高。这些结果显示，C2-神经酰胺治疗以剂量反应方式对人非小细胞肺癌细胞发挥抗生长潜力。

凋亡是程序性细胞死亡的一种形式，是一个必不可少的稳态过程。在肿瘤细胞中，促进肿瘤细胞凋亡是一种抑制肿瘤细胞生长的方式，许多化疗药物发挥作用依赖其促进细胞凋亡的发生。近年来神经酰胺与化疗药物合用，加强化疗药物的作用及降低药物耐药性已被广泛应用。Jiang et al[14]研究表明C2-神经酰胺增强索拉非尼诱导的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)细胞毒性和细胞周期阻滞。Zhang et al[15]研究表明神经酰胺有诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的作用，却没有使用其他细胞或其他类型的细胞进一步研究，但在该实验中使用了多种细胞均显示神经酰胺有促进肺癌细胞凋亡的作用且具有剂量依赖，表明C2-神经酰胺可能成为肺癌治疗或辅助治疗的试剂。