糜晓梅，杨闻君

（重庆市红十字会医院/江北区人民医院检验科，重庆 400020）

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,Ab）作为一种临床常见的革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界的水、土壤和医院环境中，此外还存在于人体皮肤、呼吸道、消化道和泌尿生殖道等全身多部位，是一种常见的条件致病菌[1‑3]。该菌在医院环境中分布较为广泛且存活时间较长，易导致危重患者院内感染的发生[4‑5]。近年来随着抗菌药物的大量使用以及不合理使用，多重耐药鲍曼不动杆菌（multi‑drug resistantAcinetobacter baumannii,MDR‑Ab）的检出率逐年升高，其感染率及致死率也日趋严重[6‑9]。鲍曼不动杆菌的耐药机制极其复杂，其中产碳青霉烯酶是MDR‑Ab最重要的耐药机制。已有研究报道由于地域性差异和医院治疗方式不同，细菌面临的选择性压力也存在一定的差异，容易引起细菌异质性耐药[10‑11]。为此，本研究针对重庆市红十字会医院2013－2020年临床各科室分离的1 008株MDR‑Ab的临床分布、耐药性和碳青霉烯酶基因进行分析，为MDR‑Ab耐药性的动态监测提供基线数据，以便制定合理有效的感染控制措施，最大限度地阻止MDR‑Ab的播散。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2013－2020年重庆市红十字会医院临床分离的MDR‑Ab 1 008株，无效标本未纳入此次研究。大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853作为本实验的质控菌株。

1.2 仪器与试剂

仪器：DL96‑Ⅱ型细菌测定系统（珠海迪尔生物工程有限公司）；欧莱博恒温培养箱（济南千司生物技术有限公司）。试剂：血平板（重庆庞通公司生产）；DL96‑Ⅱ型细菌测定系统配套的细菌鉴定卡和药敏卡（珠海迪尔生物工程有限公司）。

1.3 鲍曼不动杆菌分离鉴定及药敏试验

所有实验菌株均由DL96‑Ⅱ型细菌测定系统进行细菌鉴定和药敏分析，并采用最小抑菌浓度（mini‐mal inhibit concentration,MⅠC）法对临床常用抗菌药物进行敏感性分析，具体参照2020版CLSⅠ‑M100标准判读结果，最后通过WHONET 5.6软件对菌株的临床分布和药敏资料进行统计分析。本实验室将对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌定义为MDR‑Ab，并对各种抗菌药物耐药率进行统计分析。

1.4 碳青霉烯酶基因检测

1.4.1 模板制备MDR‑Ab菌株DNA采用金属浴煮沸法进行提取，提取后放-80℃保存备用。

1.4.2 碳青霉烯酶基因的PCR检测 以MDR‑Ab菌株DNA为模板分别进行blaOXA‐51、blaOXA‐23、blaOXA‐24和blaOXA‐58基因的PCR扩增，各引物序列根据文献设计[12]，见表1。PCR体系：Taq PCR Master Mix体系12.5μL，ddH2O 9.5μL，上下游引物各1μL，模板DNA 1μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；退火30 s，退火温度见表1；72℃，延伸根据具体根据产物长度而定；变性、退火、延伸45个循环；72℃继续延伸7 min。PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并通过凝胶成像系统观察电泳结果。

表1 PCR引物序列及产物长度Table 1 PCRprimer sequence and product length

1.4.3 碳青霉烯酶基因测序 将碳青霉烯酶基因阳性的扩增产物送重庆擎科新业生物技术有限公司测序，测序结果在GenBank进行Blast比对。

2 结果

2.1 菌株分布特征

1 008株MDR‑Ab菌株的检出率和分离率见表2。标本类型中痰液占84.2%，肺泡灌洗液占7.4%，分泌物占2.9%，中段尿占2.4%，血液占1.6%，其他占1.5%；年龄分布集中在71~90岁（占60.8%），其中81~90岁330人（占32.7%），71~80岁283人（占28.1%）；科室分布主要为重症医学科、呼吸内科、肿瘤科和神经外科。见表3~表5。

表2 2013－2020年MDR‑Ab菌株的检出情况Table 2 Detection of MDR‑Ab strains from 2013 to 2020

2.2 抗菌药物敏感性试验结果

1 008株MDR‑Ab对临床常用抗菌药物的耐药率和敏感率均存在小幅度波动但基本维持稳定。见表6。

表6 2013－2020年MDR‑Ab菌株耐药率和敏感率Table 6 Resistance and sensitivity rates of MDR‑Ab strains from 2013 to 2020 %

2.3 碳青霉烯酶基因PCR扩增结果

1 008株MDR‑Ab的blaOXA‐51、blaOXA‐23基因型的检出率分别为62.0%、71.9%，且以blaOXA‐51/blaOXA‐23基因型为主（59.5%），未检出blaOXA‐24和blaOXA‐58基因型。部分菌株PCR产物电泳见图1、图2。

图1 blaOXA‐51基因型阳性PCR产物电泳图Figure 1 PCR products of blaOXA‐51 gene

图2 blaOXA‐23基因型阳性PCR产物电泳图Figure 2 PCRproducts of blaOXA‐23 gene

2.4 PCR产物测序结果

碳青霉烯酶基因阳性菌株测序结果与GenBank进行序列比对，测序分析结果与电泳结果完全一致。

3 讨论

本研究对2013－2020年重庆市红十字会医院临床各科室分离的1 008株MDR‑Ab菌株进行了回顾性分析，结果显示，标本的质量控制较好，该菌株的检出率和分离率未见明显变化，阳性率稳定在5.8%~9.8%的检出范围内。MDR‑Ab菌株的标本类型、年龄分布、科室分布等与国内多家医院报道一致，这些病区患者多为危重症患者、老年患者或者接受过气管插管等有创治疗，大多数患者的免疫力低下，同时还由于大量使用了碳青霉烯类抗生素，造成菌群失调，使得MDR‑Ab菌株泛滥进而出现严重感染现象[13‑16]。逐年比较发现：2019年MDR‑Ab菌株出现较快增长，检出率和分离率均为最高值，而2020年的检出率和分离率却呈现较大幅度降低，这可能与近年来加强医院感染监测、注重医院感染宣传、加强手卫生和环境清洁、减少侵入性操作等各种措施有关[17‑18]。此外，药敏结果表明，1 008株MDR‑Ab菌株对大部分临床常见抗菌药物的耐药率都大于80%，仅对复方新诺明、左旋氧氟沙星和氨苄西林/舒巴坦的耐药率低于80%。8年间MDR‑Ab菌株对阿米卡星和庆大霉素的耐药率呈上升趋势，其耐药率从2013年的23.7%、80.3%上升至2020年的88.1%、96.6%，对其他常用抗菌药物的敏感率相对稳定。逐年比较发现：MDR‑Ab菌株对美罗培南、替卡西林/克拉维酸、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星的耐药率均＞90%，提示MDR‑Ab菌株对这5种抗菌药物高度耐药。

表32013 －2020年MDR‑Ab菌株标本类型及构成Table3TypesandcompositionofMDR‑Abstrainsamplesfrom2013to2020

表42013 －2020年MDR‑Ab菌株感染患者的年龄分布Table4AgedistributionofpatientsinfectedwithMDR‑Abstrainsfrom2013to2020

表52013 －2020年MDR‑Ab菌株科室分布及构成比Table5 DistributionandcompositionofMDR‑Abstrainsindifferentdepartmentsfrom2013to2020

以往研究报道，鲍曼不动杆菌存在较多的耐药机制，包括产β‑内酰胺酶、膜通透性下降、外排泵过度表达、生物膜的形成等[19]。复杂的耐药机制已成为MDR‑Ab迅速传播的主要原因，而目前临床针对MDR‑Ab治疗选择的药物非常有限，因此要求医院各部门携手并进，采取有力措施，包括：临床医护工作人员应加强医疗器械及物品的消毒管理，同时做好手卫生，并严格执行无菌操作及消毒隔离，避免院内感染的暴发流行和耐药菌的进一步播散；检验科还需要提供准确的鉴定和药敏结果，实时动态监测MDR‑Ab菌株的耐药性变化及同源性比较分析，为“精准”抗感染提供实验室依据；临床药师和临床医生需要根据药敏结果制定合理的用药方案，精准用药以延缓MDR‑Ab菌株的产生[20‑21]。

鲍曼不动杆菌是临床最常见的病原菌之一，它容易引起呼吸道、泌尿道和胃肠道等全身多部位的感染[22‑23]。碳青霉烯类抗菌药物作为革兰阴性菌感染最广谱的抗菌药物，对大多数产超广谱β‐内酰胺酶具有较高的稳定性[24]。目前，随着该类抗菌药物的广泛使用甚至过度治疗，导致临床耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌呈逐年增加趋势，且耐药范围已分布于全球各地[25]。本研究结果显示：1 008株MDR‑Ab菌株blaOXA‐51基因型阳性率为62.0%，blaOXA‐23基因型阳 性 率 为71.9%，其 中blaOXA‐51/blaOXA‐23基 因 型 占59.5%，但未检出blaOXA‐24和blaOXA‐58基因阳性携带情况，说明从携带碳青霉烯酶基因层面上来看，携带blaOXA‐51和blaOXA‐23基因产生耐药是我院鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的一个重要机制，而blaOXA‐24和blaOXA‐58基因尚未在我院传播流行。因此，预防和控制产OXA‑513酶和OXA‑23酶MDR‑Ab是医院感染是一项非常重要的工作。临床上对疑似感染患者应尽早采集标本做出多重耐药菌诊断，合理使用抗菌药物，加强重点科室的感染控制工作，以减少多重耐药菌的产生和传播。

综上所述，本研究通过对2013－2020年重庆市红十字会医院分离的MDR‑Ab菌株临床分布特征和耐药特征结果进行回顾性分析，进一步了解了医院MDR‑Ab菌株的分布情况和耐药性变迁规律，为今后MDR‑Ab菌株的耐药性动态监测提供基线数据，为更有效地控制MDR‑Ab菌株引起的感染暴发和流行提供可靠的实验室依据。