李志芳， 张 裕， 王 颖,2,3， 佐兆杭， 孙 维， 张乃丹， 周欣雨

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319) (国家杂粮工程技术研究中心2，大庆 163319) (黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室3，大庆 163319)

芸豆，又名四季豆，在我国种植广泛，已成为栽培面积仅次于黄豆的食用豆类农作物[1]，富含蛋白质、B族维生素、矿物质等营养成分，同时含有多种人体必需氨基酸，且氨基酸比例较为均衡，是一种比较难得的高钾、高镁、低钠食品[2]。芸豆含有多种活性物质，研究表明，芸豆α-淀粉酶抑制剂可有效改善链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠高脂血症、胰岛素抵抗及抗氧化防御系统，降低机体氧化应激及血糖灵敏度[3，4]；芸豆蛋白酶解成多肽后，不仅能够提高营养价值，而且方便吸收，还具有抗氧化、降血压、抗菌等多种功能活性[5]。

大豆，通称黄豆，含有丰富的优质蛋白、不饱和脂肪酸、钙及B族维生素，其高含量的蛋白质能够提供潜在活性肽，可抑制与机体氧化应激相关的疾病，如冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病等[6]。大豆中的酚类化合物具有优异的还原性能，能够通过清除ROS来抑制脂质过氧化而有效清除自由基，可作为抗氧化剂保护细胞[7，8]。发酵豆制品经过微生物及其分泌的酶系作用后，把不溶性高分子物质分解成可溶性低分子物质，保留了大豆异黄酮和低聚糖等原有功能性物质[9，10]，对于维持人类身体健康具有重要的营养价值。

芸豆和大豆本身含有许多活性物质，它们存在于各自的植物细胞中，其外层是由纤维素组成的细胞壁，机械方法能够帮助破坏植物细胞，但是对于溶出或释放活性物质的效率不高，通过微生物的生化作用能有效解决这个问题。微生物通过发酵，能够分泌多种酶并对植物细胞进行分解，从而有效地促进活性物质的释放[11]。同时，发酵原料经过多种微生物共同发酵后，会使发酵液富含多种酶类，包括超氧化物歧化酶、蛋白酶、脂肪酶等功效酶[12，13]，保护机体不受自由基损害的同时提高功能性化合物的活性[14]。目前开发的发酵豆类产品多以单一原料为主，复合发酵的研究相对较少，因此本研究选用芸豆、大豆为复合发酵原料，探究其最佳发酵条件及抗氧化活性，旨在为开发新型复合发酵产品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫花芸豆、大豆；活性干酵母、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)；耐高温α-淀粉酶(20 000 U/mL)、糖化酶(10 000 U/mL)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、羟自由基检测试盒。

1.2 仪器与设备

JYL-Y912料理机；S220 pH计；H1850R冷冻离心机；BCV-6S1超净工作台；DRP-9082电热恒温培养箱；V-5100B可见分光光度计；YXQ-30SII立式压力蒸汽灭菌器。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

菌种的活化与培养：乳酸菌活化时取10%液态保藏的植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌菌液于MRS液体培养基，37 ℃恒温培养24 h，菌液待用。酵母菌活化时活性干酵母于10倍体积蒸馏水中溶解，30～35 ℃恒温水浴锅中活化30 min，待用。

清汁的发酵：紫花芸豆、大豆清洗后去皮，按1∶3料水质量体积比打浆。双酶法进行水解，液化条件为α-淀粉酶添加量200 μL/100 mL、pH=6.0、酶解温度97 ℃、时间20 min；糖化条件为加酶量200 μL/100 mL、pH 4.5、温度60 ℃、时间30 min。酶解液于高速离心机中以1.0×104r/min离心15 min得清汁。调清汁pH 5.0、装瓶量30 mL、糖添加量8%后灭菌。冷却后接种0.2%酵母菌，32 ℃恒温振荡24 h进行预发酵，按1∶1(共同发酵)比例接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌恒温发酵24 h。4 ℃后发酵并保藏备用。

1.3.3 单因素实验设计

清汁初始pH 5.0，添加8%白砂糖后灭菌，接种3%复配乳酸菌，32 ℃发酵24 h(发酵时间由前期实验优化确定)，测定发酵液SOD活力。固定其他条件，分别考察糖添加量、初始pH、接种量、发酵温度对SOD活力的影响，使用超氧化物歧化酶(SOD)测试盒测定。

1.3.4 响应面实验设计

利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken模型，以糖添加量、初始pH、接种量、发酵温度4个单因素为自变量，以发酵液SOD活力为响应值，优化发酵工艺参数。

1.3.5 抗氧化实验

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力测定

取2 mL样品溶液与2 mL 0.02 mg/mL DPPH-乙醇溶液混匀，室温下暗反应30 min，空白组以无水乙醇代替试样，517 nm处测定样品吸光度值。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1为样品溶液的吸光度；A2为用无水乙醇代替DPPH时测得对应浓度的吸光度；A0为空白组的吸光度。

1.3.5.2 羟自由基清除能力测定

使用羟自由基测试试剂盒测定。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

由图1所示，SOD活力随糖添加量增加而升高，在糖添加量为6%时出现峰值，随后有所下降，推测糖类作为菌种发酵最重要的碳源物质，在一定范围内糖浓度增大可能诱导细胞对胞内主要代谢途径的酶活力水平有所提升[15]，但是糖浓度过高会使发酵液渗透压增高，造成细胞壁特性发生改变，使菌种生长周期停滞甚至凋亡[16]，影响发酵的正常进行。因此本实验条件下确定最适糖添加量为6%。

由图1所示，SOD活力随初始pH的增大呈先上升后下降的趋势，初始pH为4时达到峰值，原因可是SOD化学本质为蛋白质，其分子内部规律性结构易受pH、温度等物理或化学因素影响，导致氢键断裂进而使空间结构遭到破坏[17]，使酶活性降低。

接种量的高低会影响发酵初期乳酸菌的生长速度，由图可知，SOD活力随接种量的增大而增大，但当接种量大于4%时，SOD活力呈下降趋势，分析原因可能是当乳酸菌超过适宜接种量时，会缩短延滞期并很快到达对数生长期，体系的营养物质在此阶段易被迅速消耗掉[18]，不利于后期发酵的持续性进行，而接种量过低易污染杂菌不利于菌种生长增殖[19]，因此选用4%为最佳接种量以保证发酵过程的正常进行。

发酵温度会影响微生物的生长代谢，进而影响发酵液中抗氧化物质含量和活性[20]。由图1所示，SOD活力随着发酵温度的升高逐渐增大，说明发酵温度的升高有利于增强微生物的活性，可促进维生素C、酚类等抗氧化物质的溶出或产生[21]，使体系抗氧化物质含量增加而增强SOD活力，但是温度过高就会抑制微生物中酶的活性，同时缩短发酵周期，影响微生物的正常生长代谢，从而使产生的SOD及各产物量变低。因此本实验条件下选用32 ℃为最佳发酵温度。

图1 单因素实验结果

2.2 响应面实验结果分析

2.2.1 响应面实验因素与水平设计

响应面实验因素与水平设计表见表1。

表1 响应面实验因素与水平

2.2.2 响应面结果及分析

响应面设计各因素水平的复合发酵液SOD活力见表2。对表2实验结果进行回归拟合，所得回归方程为：Y=270.03+2.44A-2.20B+4.43C+0.64D-2.10AB-4.23AC+2.72AD+6.16BC-5.05BD-1.92CD-23.06A2-18.79B2-18.64C2-11.43D2。

表2 响应面实验设计与结果

表3 回归方程方差分析及结果

2.2.3 交互作用分析

通过三维响应面和二维等高线图分析可得，随着糖添加量、初始pH、接种量和发酵温度的增大，发酵液SOD活力随之增大，但当4个因素增加到一定程度时，SOD活力呈下降趋势，其中初始pH与接种量、发酵温度两因素交互作用等高线图密集成椭圆形，说明两因素交互作用显著，由响应面图对比可知，接种量和糖添加量曲面弯曲程度较大，表明其对发酵液SOD活力影响显著，与方差分析结果相一致。经Design Expert 8.0.6优化复合发酵液工艺参数得：糖添加量6.10%，初始pH 3.98，接种量4.10%，发酵温度32.07 ℃，此条件下发酵液SOD活力预测值可达270.383 U/mL。考虑到实践操作可行性，调整工艺参数为糖添加量6%、初始pH 4.0、接种量4%、发酵温度32 ℃，重复3次实验得复合发酵液SOD活力为268.46 U/mL(误差0.61%)，与理论值基本吻合，证明优化的工艺参数具有准确性。

2.3 不同发酵阶段复合发酵液抗氧化活性分析

2.3.1 发酵过程中DPPH自由基清除率变化

DPPH是一个以氮原子为中心的稳定脂溶性自由基，是体外检测物质抗氧化效果最常用的一种方法，可在短时间内较稳定评价物质抗氧化活性[22]。如图2所示，整个发酵过程中，发酵液对DPPH自由基清除率呈先迅速上升后趋于平缓的趋势。发酵24 h时，DPPH自由基清除率迅速增长约2倍，随后以小幅趋势继续增长，说明在适当发酵时间内，发酵液DPPH自由基清除能力会随发酵时间的延长而有所提高，至发酵结束可达90.72%，分析原因可能与发酵过程释放的酚类、黄酮物质有关，同时发酵过程中产生如超氧化物歧化酶等抗氧化酶，它们共同作用可提高DPPH自由基清除率。

图2 发酵过程中DPPH、羟自由基清除能力的变化

2.3.2 发酵过程中羟基自由基清除能力变化

羟自由基是一种重要的活性氧，是人体在新陈代谢过程中产生的对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，它可以使组织中的糖类、氨基酸、蛋白质、核酸等物质发生氧化，遭受氧化性损伤和破坏，导致细胞坏死或突变[23]。如图2所示，羟基自由基的清除能力随发酵时间的延长呈现持续增长的趋势，发酵结束时清除能力增长至606.26 U/mL，约为发酵初始值的2倍。羟基自由基清除能力的提高可能是由于发酵液中有机酸、大豆多酚等包含有自由羟基的酚类物质，能提供活泼的氢终止自由基连锁反应。同时，发酵能够将大分子蛋白分解为末端氨基酸残基具有抗氧化活性的小分子多肽[24]，增强体系抗氧化能力。

3 结论

通过对芸豆/大豆复合发酵液工艺参数优化及功能性分析，结果表明：复合发酵液最优工艺条件为糖添加量6%、初始pH 4.0、接种量4%、发酵温度32 ℃，此条件下发酵液SOD活力为268.46 U/mL。复合发酵液DPPH自由基清除率及羟自由基清除率能力显著增长，至发酵结束其清除能力分别为90.72%和606.26 U/mL，证明经工艺优化后的发酵液具有良好的抗氧化活性。