唐 众，凌 洁，黄维芳

(湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410008)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[1]。据世界卫生组织国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC )公布的2020年全球最新癌症负担数据显示，全球乳腺癌新发病例高达226万例，超过了肺癌的220万例，乳腺癌取代肺癌成为全球第一大癌，同时每年超过68万人死于乳腺癌[2-3]。目前针对乳腺癌的治疗手段众多，但多数治疗手段具有不同程度的毒副作用，难以满足乳腺癌患者的需求[4]。诸多研究表明，中医药治疗乳腺癌存在多通路、多靶点的优势，能够有效改善临床症状，延缓远处转移，延长生存期限，提高生活质量[5-6]。消痈乳康方是湖南中医药大学第一附属医院乳腺科临床运用多年证实有效的治疗乳腺疾病的验方，该方用于治疗乳腺癌有较好的临床效果。本实验从Janus蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)通路角度观察了消痈乳康方对乳腺癌MCF-7细胞恶性肿瘤生物学行为的影响，以进一步探究消痈乳康方的作用机制，为中医药治疗乳腺癌提供新思路与新方法。

1 实验材料与方法

1.1实验细胞 乳腺癌MCF-7细胞株，保存于湖南中医药大学第一附属医院中心实验室(中国科学院细胞库目录号：TCHu 74)。

1.2实验试剂及仪器 胎牛血清、1640细胞培养基、双抗、0.25%胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司(生产批号：1640958，AD24221175，SV345103，SH30042)；培养瓶、离心管、巴氏管等一般消耗品购于美国NEST公司；细胞侵袭小室、AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购于美国Thermo公司(生产批号：TH269087，THB334077)；兔抗JAK2、兔抗磷酸化JAK2(p-JAK2)、兔抗STAT3、兔抗磷酸化STAT3(p-STAT3)抗体均购于美国Proteintech公司；SYBR Green PCR检测工具购于美国SantaCruz公司(FAST480Ⅱ型)。实验仪器均为中南大学湘雅医学院中心实验室提供，倒置生物显微镜购于日本Olympus公司(OY34004型)；流式细胞仪购于美国BD公司，其余仪器均由实验室提供。

1.3实验药物制备 消痈乳康方组方：郁金15 g、肉苁蓉15 g、女贞子15 g、乳香10 g、没药10 g，中药饮片购于湖南中医药大学杏林门诊部药房并经湖南中医药大学第一附属医院全国名中医刘绍贵教授进行鉴定。将中药饮片研磨成粉末，按一定比例煎煮浓缩后制成膏状物，并按人临床等效浓度配制成含原药材2.88 g/mL。在使用前根据实验要求的浓度以分析天平称取消痈乳康方浸膏并置于PBS中，借助超声震荡仪进行震荡处理30 min使其充分溶解，吸取其上清液并借助0.22 μm的滤膜完成杂质滤过，以棕色瓶避光储存于4 ℃冰箱。在使用时以1640基础培养基进行稀释。

1.4细胞培养与分组 MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基，培养箱环境设置为5% CO2、温度37 ℃。将细胞分为4组：空白对照组以1640培养基进行干预，消痈乳康方高浓度组、消痈乳康方中浓度组、消痈乳康方低浓度组以16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL的消痈乳康方进行干预。

1.5检测指标及方法

1.5.1CCK8法检测细胞增殖情况 在培养箱环境中培养MCF-7细胞至对数生长期，离心后将其密度调整至1×107/mL。将细胞悬液200 μL种植至96孔板，并设置6个复孔进行观察，静置24 h以倒置显微镜观察到MCF-7细胞完全贴壁后，消痈乳康方各浓度组加入相应浓度的消痈乳康方药液分别干预24 h、48 h、72 h，运用CCK8法检测细胞在490 nm波长处的光密度(OD)值。细胞抑制率=(1-OD值药物组/OD值对照组)×100%。

1.5.2流式细胞法检测细胞凋亡情况 在培养箱环境中培养MCF-7细胞至对数生长期，接种至无菌6孔板中。各组加入对应的培养基，干预24 h后离心收集细胞，置于0.1 mL的binding buffer中，将其密度调整至1×105/mL，PBS清洗后加入AnnxinV及PI染液(终质量浓度均为5 μg/mL)，孵育15 min后再次加入binding buffer，过滤后置于流式细胞仪检测并计算各组细胞凋亡率。

1.5.3Transwell法检测细胞侵袭能力 按照标准Transwell法检测MCF-7细胞的侵袭能力，提前预冷试剂及操作器械，在4 ℃环境下将Matrigel基质胶均匀平铺于Transwell小室并静置30 min；空白培养基洗涤Transwell上室备用。在培养箱环境中培养MCF-7细胞处于对数生长期，离心后将其密度调整至5×105/mL；移液枪将细胞液悬液200 μL吸取至Transwell上室中，空白对照组添加1640培养基、消痈乳康方各浓度组添加相应浓度的消痈乳康方药液继续培养24 h；之后添加200 μL含15%的完全培养基至下室，置于5% CO2、温度37 ℃的培养箱中进行培养，多聚甲醛固定10 min后以DAPI进行避光染色，之后随机选取6个视野观察拍照并计算穿膜细胞数。

1.5.4RT-PCR法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表达 收集各组采用相应方法培养48 h后的MCF-7细胞，提取其总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性与纯度,要求能够清晰呈现28s、18s条带,OD260 / OD280 比值介于1.8～2.0之间。取总RNA 20～50 μg,去除RNA基因组,按照试剂盒说明书合成cDNA第一链，同时以β-actin作为内参基因并扩增。参照说明书设定PCR程序,95 ℃ 10 min变性,然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,重复40 个循环进行扩增。反应结束,设定最佳阈值,获取Ct(threshold cycle)值，以相对定量2-ΔΔCt分析上述基因相对表达水平。

1.5.5Western blot法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达 收集各组采用相应方法培养48 h后的MCF-7细胞，提取相关蛋白，经凝胶电泳、转印、洗膜、封闭等操作后添加JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗体(1∶2 000)，4 ℃环境静置过夜。洗膜后添加对应二抗(1∶5 000)，室温环境下静置30 min后进行显色操作，将β-actin作为内参蛋白，并在Quantity One软件上进行分析。

2 结 果

2.1各组MCF-7细胞抑制率比较 消痈乳康方低、中、高浓度组处理MCF-7细胞24 h、48 h、72 h后细胞抑制率均明显高于空白对照组(P均<0.05)，且消痈乳康方低、中、高浓度组细胞抑制率逐渐增高，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 各组乳腺癌MCF-7细胞抑制率比较

2.2各组MCF-7细胞形态 倒置显微镜下，空白对照组培养24 h后MCF-7细胞贴壁，生长良好，呈长梭形或多边形，细胞个体饱满，胞质丰富，轮廓清晰，呈簇状聚集；消痈乳康方各浓度组均可见贴壁细胞数量明显减少，呈散在排列，部分细胞体积改变，胞浆内出现空泡变性，细胞结构不完整，裂解成碎片，其中消痈乳康方高浓度组最为显著。见图1。

图1 倒置显微镜下各组培养24 h后乳腺癌MCF-7细胞形态(×200)

2.3各组 MCF-7细胞凋亡率比较 培养24 h后，空白对照组和消痈乳康方低、中、高浓度组的MCF-7细胞总凋亡率(Q2+Q4)分别为(6.63±2.14)%、(20.06±3.25)%、(31.52±3.64)%、(38.21±4.02)%，消痈乳康方各浓度组均明显高于空白对照组(P均<0.05)，且消痈乳康方低、中、高浓度组逐渐增高，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。流式细胞图见图2。

图2 各组培养24 h后乳腺癌MCF-7细胞凋亡情况

2.4各组MCF-7细胞侵袭能力比较 培养24 h后，消痈乳康方低、中、高浓度组和空白对照组MCF-7细胞穿膜数分别为(86.46±4.65)个、(62.25±4.02)个、(36.57±3.45)个、(146.57±5.24)个，消痈乳康方各浓度组细胞穿膜数均明显少于空白对照组(P均<0.05)，且消痈乳康方低、中、高浓度组细胞穿膜数逐渐减少，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 各组培养24 h后乳腺癌MCF-7细胞侵袭情况(×400)

2.5各组MCF-7细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA表达情况比较 培养48 h后，消痈乳康方低、中、高浓度组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相对表达量均明显低于空白对照组(P均<0.05)，且消痈乳康方低、中、高浓度组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相对表达量逐渐降低，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 各组乳腺癌 MCF-7细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA相对表达量比较

2.6各组MCF-7细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达情况比较 培养48 h后，消痈乳康方低、中、高浓度组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白相对表达量均明显低于空白对照组(P均<0.05)，且消痈乳康方低、中、高浓度组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白相对表达量逐渐降低，组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图4及表3。

表3 各组乳腺癌MCF-7细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白相对表达量比较

图4 各组乳腺癌 MCF-7细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达情况

3 讨 论

目前全球范围内乳腺癌的发病率持续升高并呈年轻化态势，极大程度上威胁了女性的生命与健康。

Sharma等[7]针对3 566名乳腺癌患者进行大数据调查结果显示，乳腺癌较强的转移侵袭的生物学特性是造成患者死亡的重要原因。目前早期乳腺癌主要采取手术治疗，术后根据患者情况给予放化疗、靶向治疗等多途径、多策略干预[8-9]，但多数治疗手段存在程度不一的毒副反应，因此寻求高效、低毒副作用的治疗方法势在必行。中医认为乳腺癌属于“乳岩”“石乳”“石奶”等疾病范畴，其发病多为外邪侵袭、七情内伤导致冲任失调、气滞血瘀、阳虚寒凝，日久迁延，则虚、寒、瘀、痰等病因及病理产物于乳房局部停滞形成乳腺癌[10-11]。消痈乳康方具有调摄冲任、活血化瘀、温经散寒等功效，切合上述病机，但其作用机制尚不明确，故本实验进行了相关探讨。

乳腺癌的发病机制仍未完全明确，大多数研究认为其发生可能与女性基因缺陷、自身免疫因素、内分泌紊乱、生活作息、饮食或环境等因素相关[2]。近年来研究显示，JAK2/STAT3信号通路可能在乳腺癌的发生发展进程中扮演着极为重要的角色[12]。Ding等[13]研究显示，JAK2/STAT3信号传导通路能够介由对下游各类影响因子及效应分子进行活化，进而对乳腺癌细胞的增殖、凋亡以及细胞周期进行调控，是乳腺癌细胞产生侵袭转移生物学特性的重要信号通路之一。STAT3基因被认为是多种恶性肿瘤的关键靶点，JAK2/STAT3信号通路是STAT3基因信号转导以及转录激活的关键信号通路。Zhang等[14]研究表明，在乳腺癌的发生发展过程中，往往伴随着JAK基因与STAT基因的非正常表达及异常活跃，特别是在乳腺癌的侵袭转移阶段，JAK2/STAT3信号通路多处于稳定的活化状态。JAK2/STAT3信号传导通路中的关键基因JAK2、STAT3能够调控G1/S-特异性周期蛋白-D1(cyclinD1)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)以及促凋亡基因Bax等肿瘤细胞关键调控蛋白的表达，参与恶性肿瘤细胞凋亡、增殖以及侵袭转移等多个恶性生物学进程，与乳腺癌的生长、转移、侵袭息息相关[15]。Nafie等[16]研究表明，乳腺癌细胞的增殖过程中JAK2/STAT3信号通路可明显上调Bcl-2以及cyclinD1的蛋白表达，通过药物抑制JAK2/STAT3信号通路能够有效促进乳腺癌细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞增殖。Zhang等[17]研究显示，JAK2/STAT3信号通路的异常活化密切参与了乳腺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移及肿瘤小血管生成等。Noori等[18]认为JAK2/STAT3信号通路是乳腺癌新药开发的最热门靶点信号通路之一。

本实验结果显示，消痈乳康方各浓度组MCF-7细胞抑制率和凋亡率均明显高于空白对照组，细胞穿膜数均明显少于空白对照组，JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 mRNA和蛋白相对表达量均明显低于空白对照组，并表现出浓度依赖性。提示消痈乳康方可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭，促进细胞凋亡，机制可能与其抑制JAK2/STAT3信号通路激活有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。