戴富才，赵娣，李红美，苏月月，景学敏，张晓轩

廊坊师范学院化学与材料科学学院（廊坊 065000）

菝葜（Smilax china）为百合科植物菝葜属，又名金刚藤、金刚刺，主要分布于我国长江以南及东南亚等地。菝葜根、茎、叶 均可入药，菝葜中主要包含氨基酸、茋类、皂苷类、黄酮类、酚酸类等各种化学成分，具有祛风利湿、消肿解毒、抗炎镇痛、抗肿瘤、降血糖、预防动脉粥样硬化等作用[1]。

绿原酸（chlorogenicacid）是由咖啡酸（caffeicacid）与奎尼酸（quinicacid）组成的缩酚酸，具有抗病毒、抗氧化、抗衰老、免疫调节、降糖、增加白细胞数量等多种生理作用[2]。绿原酸主要从金银花[3]、杜仲[4]等天然产物中提取。市场上绿原酸供应不足，导致绿原酸价格居高不下。所以扩大绿原酸的提取来源并研究其提纯工艺十分有必要。试验选取菝葜为绿原酸提取的植物来源。

绿原酸的提纯方法主要有水提醇沉、石灰乳沉淀法、膜分离法、重结晶法、溶剂萃取法、离子交换树脂法、凝胶色谱法、高效液相色谱法、高速逆流色谱法和大孔树脂分离等方法[5]。其中，大孔树脂理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，便于工业化生产，在绿原酸的分离与富集中被广泛应用。沈奇等[6]选用NKA-9大孔树脂来分离蒲公英中的绿原酸，提纯后，绿原酸提取物纯度可达25.3%。大孔树脂对菝葜中绿原酸的提纯工艺尚未见报道，因此，如何以菝葜为原料，研究大孔树脂提纯绿原酸的工艺，成为我们研究的内容。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菝葜（产自河北省保定市）；绿原酸标准品（纯度＞98%，武汉天植生物技术有限公司）；大孔树脂NKA-Ⅱ、NKA-9、HPD400、AB-8、X-5、D101等（分析纯，天津市精细化工研究所）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市渤化化学试剂有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260型高效液相色谱（配自动进样器和紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司）；XFB-400高速中药粉碎机（湖南吉首市中湘制药机械厂）；KQ-250B超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FA1640A电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；酒精计（河北省武强红星玻璃仪表厂）；TD4台式低速离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 菝葜中绿原酸的HPLC检测方法

1.3.1.1 HPLC法检测条件[7]

色谱柱为SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相，色谱纯乙腈-0.1%磷酸水溶液（体积比随时间变化见表1）；流速1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长327 nm；进样量10 μL。

表1 乙腈与磷酸水溶液的体积比随时间变化表

1.3.1.2 绿原酸标准品的配制及工作曲线的绘制

精确称取5.0 mg绿原酸的标准品，用50%的色谱纯甲醇溶解并定容于25 mL的棕色容量瓶中，即得到质量浓度0.2 mg/mL的绿原酸标准品溶液。于4 ℃左右保存，待用[8]。

将标准品溶液稀释，稀释至质量浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL，用高效液相色谱法测定峰面积。以绿原酸的质量浓度为横向坐标，液相色谱的峰面积为纵向坐标，绘制绿原酸的工作曲线，并计算其线性方程[9]。

取所需待测的样品溶液，经0.45 μm的滤膜过滤，用于高效液相色谱分析[10]。

1.3.2 菝葜绿原酸吸附率、解吸绿、得率、含量和产率

按式（1）～（5）计算[4，11]。

式中：E为绿原酸吸附率，%；C0为起始质量浓度，mg/mL；Ce为平衡质量浓度，mg/mL；D为绿原酸解吸率，%；Cd为解吸液中绿原酸质量浓度，mg/mL；Vd为解吸液体积，mL；V0为吸附液体积，mL；R为绿原酸得率，%；P为绿原酸含量，%；m为解吸液干物质总质量，g；Y为绿原酸产率，%；M为菝葜干粉质量，g。

1.3.3 树脂预处理及再生

用95%乙醇浸泡6种待处理的大孔树脂24 h，使其充分膨胀后，用去离子水洗去乙醇；用5%盐酸溶液浸泡12 h，用去离子水洗至中性（pH试纸检测），用5%氢氧化钠溶液浸透12 h，用去离子水冲洗至中性，待用[11]。

1.3.4 拔葜绿原酸粗提液的制备

用粉碎机将菝葜粉碎，过0.250 mm（60目）筛，待用。

称取20 g的菝葜粉末，按照料液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇溶液摇匀，使粉末浸湿后，按照超声时间35 min、超声功率135 W进行超声提取，过滤，提取2次，合并滤液[12]，减压蒸馏浓缩至无醇味（酒精计测量乙醇体积分数约2%），离心分离（3 000 r/min，离心5 min），合并上清液即为菝葜粗提液。

1.3.5 大孔树脂D101吸附除杂

将菝葜粗提液和D101大孔树脂（比例为50∶1 mL/g）放在25 ℃、110 r/min的摇床上振荡24 h。将振荡后的溶液进行过滤，滤液即为大孔树脂D101除杂后溶液，测定其中绿原酸含量，备用。

1.3.6 大孔树脂提纯菝葜中绿原酸的单因素试验

以大孔树脂D101除杂后溶液为原料液，以树脂提纯后样品中绿原酸的含量和得率为指标，研究树脂种类、吸附液pH、吸附液浓度、解吸液乙醇体积分数等因素对大孔树脂提纯菝葜绿原酸的影响[4]。

1.3.6.1 树脂种类对提纯工艺的影响

将原料液用6 mol/L盐酸调节至pH 2，在5个250 mL的锥形瓶中各放入150 mL，放入已经处理好的NKA-II、NKA-9、HPD400、AB-8、X-5树脂各3 g，放在25 ℃、110 r/min的摇床上振荡24 h。取出后抽滤，测定吸附液中未吸附的绿原酸的含量。将抽滤后的树脂用适量的pH 3的酸水冲洗、抽滤干后，放入原锥形瓶中，分别加入50 mL 40%的乙醇，放在25 ℃、110 r/min的摇床上振荡解吸24 h。用HPLC法测定过滤后解吸液中绿原酸含量；将解吸出的溶液蒸干，测定干物质质量，计算不同树脂种类下绿原酸的含量和得率。

1.3.6.2 吸附液pH对提纯工艺的影响

将吸附液pH调至1，2，3，4和5后，其他条件不变，参照1.6.3.1进行吸附解吸试验，研究吸附液pH对提纯工艺的影响。

1.3.6.3 吸附液质量浓度对提纯工艺的影响

将吸附液质量浓度调至0.04，0.08，0.12，0.16和0.20 mg/mL，其他条件不变，参照1.6.3.1进行吸附解吸试验，研究吸附液质量浓度对提纯工艺的影响。

1.3.6.4 解吸液乙醇体积分数对提纯工艺的影响

将解吸液乙醇体积分数调至20%，30%，40%，50%和60%，其他条件不变，参照1.6.3.1进行吸附解吸试验，研究解吸液乙醇体积分数对提纯工艺的影响。

1.3.7 大孔树脂提纯菝葜中绿原酸的正交试验

根据单因素试验结果，以绿原酸含量和得率为指标，选择A（树脂种类）、B（吸附液pH）、C（解吸液乙醇体积分数）、D（吸附液质量浓度）4个因素，设计L9(34)正交试验。

1.3.8 大孔树脂动态提纯菝葜中的绿原酸

1.3.8.1 上柱样体积和流速的测定

将最优树脂放入3支1.2 cm×40 cm的玻璃层析柱中，高度15 cm左右，将经过D101树脂除杂后的原料液按照正交试验确定的以绿原酸含量为指标确定的最佳静态吸附工艺条件进行动态吸附试验。分别控制流速1，2和3 BV/h，每柱体积收集1次，并进行液相色谱检测，在流出液绿原酸的质量浓度为上样液绿原酸质量浓度的l/10时即达到泄漏点[13]，认为绿原酸透过，停止上样。确定上样液体积及流速。

1.3.8.2 解吸液体积对解吸效果的影响

将吸附绿原酸达到泄漏点的树脂，按照正交试验得出的最优解吸条件进行解吸。前2 BV解吸液收集在一起，后每隔1 BV收集1次，分别取样，进行HPLC检测，测定解吸液中绿原酸含量，确定最优解吸液体积。

1.3.8.3 绿原酸含量和产率的计算

取120.000 0 g菝葜干粉，按照最优工艺提纯，按照式1.3.2中公式（4）计算纯化过程的绿原酸含量变化，按照公式（5）计算纯化后绿原酸产率。

1.3.9 大孔树脂NKA-Ⅱ的重复使用次数试验

将工艺用量较大的NKA-Ⅱ树脂使用后按照1.3.3再生后重复使用。

将再生好的NKA-Ⅱ树脂放入1.2 cm×40 cm的玻璃层析柱中，高度15 cm，将经过D101树脂除杂后的原料液按照最优工艺进行吸附试验。当吸附率降至新树脂对绿原酸吸附率的70%[14]时，停止再生，记录树脂的重复使用次数。

2 结果与分析

2.1 绿原酸标准曲线

标准曲线的回归方程为y=31 508.29x+285.49，R2=0.995。其中：y为绿原酸色谱峰面积，mAU；x为绿原酸质量浓度，mg/mL。结果表明绿原酸在0.01～ 0.06 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 树脂种类对绿原酸提纯效果的影响

由表2可知：极性树脂纯化效果好于弱极性树脂和非极性树脂，这是因为绿原酸是有一定极性的有机酸，更容易被极性树脂吸附[15]。NKA-II树脂纯化后得率和含量最高，因此选择NKA-II树脂作为最优树脂，进行后续单因素试验，NKA-II、NKA-9和HPD400树脂为正交试验中树脂种类的3个水平。

表2 树脂种类对绿原酸提纯效果的影响

2.2.2 吸附液pH对绿原酸提纯效果的影响

由图1可知：pH 2时，纯化后绿原酸含量最高，这是因为绿原酸是有机酸，酸性环境下绿原酸以分子形式存在，有利于树脂对绿原酸分子的吸附[6]。弱酸性环境也有利于黄酮类等其他物质的吸附[13]，因此pH 4时，绿原酸得率虽然最高，但是绿原酸含量却不是最高。考虑到试验的主要目的是提高产品中绿原酸的含量，因此，以纯化后绿原酸含量最高的pH 2作为单因素试验的最优pH，选择pH 1，2和3作为正交试验中吸附液pH的3个水平。

图1 吸附液pH对绿原酸提纯效果的影响

2.2.3 吸附液质量浓度对绿原酸提纯效果的影响

由图2可知：吸附液质量浓度越小，绿原酸得率越大，随着吸附液质量浓度上升，绿原酸含量先增大后减小。考虑到试验的主要目的是提高产品中绿原酸的含量，因此，选择0.08 mg/mL为吸附菝葜绿原酸的吸附液质量浓度，开展后续单因素试验；选择吸附液质量浓度0.04，0.08和0.12 mg/mL为正交试验中吸附液质量浓度的3个水平。

图2 吸附液质量浓度对绿原酸提纯效果的影响

2.2.4 解吸液乙醇体积分数对绿原酸提纯效果的影响

由图3可知，随着解吸液乙醇体积分数的增大，绿原酸得率逐渐增大，而绿原酸含量先增大后减小。因为与水相比，绿原酸在乙醇中的溶解度更大。由相似相容原理，较大的乙醇体积分数对绿原酸的解吸更有利；但较大的乙醇体积分数也有利于黄酮类物质等其他醇溶性成分的解吸[11，13]。考虑到试验的主要目的是提高产品中绿原酸的含量，因此，选择50%作为最优解吸液乙醇体积分数，选择40%，50%和60%为正交试验中解吸液乙醇体积分数的3个水平。

图3 解吸液乙醇体积分数对绿原酸提纯效果的影响

2.3 正交试验

由表3可知，以菝葜绿原酸含量为指标，各因素影响的大小依次为树脂种类＞吸附液pH＞解吸液乙醇体积分数＞吸附液质量浓度。其中，树脂种类显著影响。最佳组合为A1B1C1D2，即大孔树脂采用NKA-Ⅱ、吸附液pH 1、解吸液乙醇体积分数40%、吸附液质量浓度0.08 mg/mL。

由表3可知：以菝葜绿原酸得率为指标，各因素影响的大小依次为解吸液乙醇体积分数＞树脂种类＞吸附液质量浓度＞吸附液pH；其中，解吸液乙醇浓度显著影响；最佳组合为A1B3C3D3，即大孔树脂采用NKA-Ⅱ、pH 3、解吸液乙醇体积分数60%、吸附液浓度0.04 mg/mL。

表3 正交试验因素水平及结果

为验证正交试验中获得最优的组稳定性和准确性，在最优组合下，各进行3次平行试验。即以绿原酸含量为指标，含量的平均值为6.4%，得率平均值为52.3%。以绿原酸得率为指标，含量的平均值为5.0%，得率的平均值为63.9%。

2.4 动态试验分离纯化菝葜中的绿原酸

2.4.1 泄漏点的测定及流速对树脂吸附的影响

大孔树脂提纯天然产物时，一般较低的流速有利于吸附[13]，然而流速过低，完成吸附的时间就要延长，降低提纯效率。图4为不同流动速度下，流出液中绿原酸质量浓度的变化图。流速1 BV/h时，10 BV达到绿原酸泄漏点，流速2 BV/h时，8 BV达泄漏点，虽然完成1周期吸附，少处理2 BV样品液，但吸附速度提高1倍。因此，综合考虑处理量和吸附速度，2 BV/h为最佳上样液流速，在此流速下，上样液体积为8 BV。

图4 上样液流速对树脂吸附的影响

2.4.2 解吸液体积对解吸效果的影响

由图5可知，解吸液体积为前2 BV时，流出液主要为杂质，绿原酸含量很小，不收集。当解吸液体积达到5 BV时，大部分绿原酸被解吸下来，继续增加解吸体积可能将树脂吸附的部分杂质解吸出来，影响纯化效果。因此，解吸液体积控制在5 BV，收集第3～第5 BV解吸液。

图5 解吸液体积对解吸效果的影响

2.5 菝葜绿原酸含量和产率

2.5.1 菝葜绿原酸含量（见表4）

表4 纯化过程中绿原酸含量的变化

2.5.2 菝葜绿原酸的产率（见表5）

表5 菝葜绿原酸的产率

2.6 树脂NKA-Ⅱ的重复使用次数

由表6可知，由于一些强吸附性杂质的影响，树脂第8次再生后，对绿原酸的吸附率将至59.3%，低于61.3%（即新树脂吸附率的70%），认为不能继续使用。因此，经过再生，NKA-Ⅱ树脂共可以使用8次，8次后需要更换新树脂。

表6 树脂再生后使用次数对绿原酸吸附率的影响

3 结论

以菝葜为原料，利用超声波粗提，经大孔树脂D101除杂，NKA-Ⅱ树脂提纯的工艺，可有效提纯菝葜中绿原酸。提纯后，菝葜绿原酸含量显著提高。树脂NKA-Ⅱ再生处理后，共计可使用8次。试验可为菝葜中绿原酸的工业生产提供数据参考。