赵 倩，王 堃，罗 庆，王天文，孟平红，谭国飞*

(1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院，山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室，山地生态与农业生物工程协同创新中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州省农业科学院园艺研究所，贵州 贵阳 550006)

0 引言

胡萝卜(DaucuscarotaL.)为伞形科作物，根是胡萝卜的主要食用部位，中国的胡萝卜种植面积和产量均为世界第一[1]。胡萝卜肉质根中，富含胡萝卜素、维生素、糖及矿物质等多种营养物质，已被深入和广泛的研究。其他物质研究研究较少，如补骨素。

补骨素(Psoralen)属呋喃香豆素中重要的药物成分之一，具有镇定、止血等功能，在软骨再生、强效补骨、强健骨质、润滑关节、必得软骨、对抗磨损等方面也具有重要功能，还是治疗白癜风、斑秃、牛皮癣和瘤样等皮肤病的特效药[2-4]。胡萝卜作为重要的营养蔬菜，除作为蔬菜食用外，已被增加到婴幼儿和老人奶粉中，且补充骨质成分成为奶粉重要指标之一[5]。因此，研究胡萝卜补骨素代谢机理和提高胡萝卜中补骨素的含量，具有积极意义。

补骨素合成开始于苯丙氨酸代谢(形成肉桂酸)，经过羧化酶、连接酶、内酯化催化形成的伞花内脂，进一步由印度枸橘素合成酶催化形成异化前胡素内脂，最后由补骨素合成酶催化形成补骨素[2,6-7]。其中，补骨素合成酶(Psoalen synthase,PS)作为补骨素合成中关键酶，其基因功能最先是在伞形科阿米芹中被确认[2]，其后在伞形科植物的欧防风[8]、珊瑚菜[9]中被成功克隆，而在胡萝卜中未见研究报道。本研究对胡萝卜DcPS基因进行了克隆、序列结构、进化及在肉质根膨大过程中的表达分析，对研究胡萝卜中补骨素物质的合成提供指导。

1 材料与方法

1.1 植物材料及栽培条件

‘黑田五寸’(Kuroda)是贵州省农业科学院园艺研究所伞形科蔬菜课题组多年提纯的材料， 2018年8月播种于贵州省农业科学院园艺研究所蔬菜试验地中。试验地在耕地时每亩施用2 000 kg的鸡粪外，在胡萝卜生长过程中未使用肥料。分别于胡萝卜发芽(约10 d)后10 d、20 d、40 d、60 d、80 d和100 d时，选取植株根部用ddH2O洗净后，迅速用锡箔纸包好并快速置于液氮中速冻，并保存于-80 ℃超低温冰箱中，用于提取胡萝卜总RNA。

1.2 胡萝卜RNA的提取、鉴定及cDNA的合成

取保存于-80 ℃冰箱中不同发育时间段的胡萝卜根，放置于冷却的研钵(研钵预先用180 ℃烘箱灭菌2～3 h )中，加入液氮进行充分研磨。采用RNA Simple Total RNA Kit(Tiangen，北京)RNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行胡萝卜总RNA的提取，其完整性和浓度，分别使用胶浓度为1.2%琼脂糖凝胶和微量分光光度计Nanodrop ND-100(Nanodrop Technologies Inc.，DE，USA)进行检测。胡萝卜总RNA利用含有去除基因组DNA的反转录试剂盒(PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit(Perfect Real-Time)，TaKaRa，大连)将其反转录成cDNA，并用灭菌的ddH2O稀释15倍，保存于-20 ℃冰箱，用于胡萝卜DcPS基因的克隆及荧光定量PCR分析。

1.3 胡萝卜DcPS基因的克隆与鉴定

以公布的阿米芹AmPS基因序列(GenBank: AY532370.2)比对南京农业大学园艺学院熊爱生课题组建立的胡萝卜数据库(http://apiaceae.njau.edu.cn/)和NCBI胡萝卜基因组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=txid79200[Organism:noexp])，发现2个数据库中对应的DcPS基因存在差异。其中，南京农业大学园艺学院胡萝卜数据库中该基因(基因编号：Dck09486.1)开放阅读框长度(ORF)1 518 bp，而NCBI中该基因(GenBank: XM_017393936.1)ORF长度为1 545 bp，但2个数据库5′一致，3′存在差异。为此，以NCBI公布的DcPS基因设计5′正向引物，以经过克隆和验证的阿米芹AmPS基因序列设计3′反向引物，其正向为：5′-ATGGCAATGAAAATGGTGGAGCAA-3′；反向为：5′-TCAAACATGTGGTCTGGCAACCACC-3′ 。

PCR采用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的高保真PCR聚合酶Taq Plus Master Mix Ⅱ，对DcPS基因进行克隆。克隆程序为：94 ℃预变性5 min；然后按照94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，32个循环后，于72 ℃延伸10 min；最后12 ℃保存。克隆产物经过1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后，在紫外灯下用干净的手术刀快速切下目的条带，使用Axygen胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)并按照说明书，回收基因目的片段。将目的片段连接到pMD19-T(TaKaRa，大连)载体上。连接好的载体利用42 ℃热激的方法，转化到大肠杆菌DH5α，涂布于含有浓度100 mg·L-1的氨苄青霉素LB固体培养基中，黑暗条件下37 ℃倒置培养12～14 h。挑取单菌落在含有浓度100 mg·L-1的氨苄青霉素LB液体培养基中，于摇床180 rpm下培养6 h后，采用PCR方法对菌液进行检测，对检测正确的菌液，送到南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

1.4 胡萝卜DcPS进化分析

将克隆得到的胡萝卜DcPS基因，查找可翻译的阅读框，并推导成对应的氨基酸序列。获得的胡萝卜DcPS氨基酸序列与其它伞形科植物构建进化树，其中欧芹、水芹、旱芹和鸭儿芹分别从课题组建立的伞形科蔬菜数据库中搜索获得。使用MEGA5软件的最大似然(Minimum likelihood，ML)法构建系统进化树，Bootstrap检验值设为1 000[10]。

表1 各伞形科物种SP 蛋白信息Tab.1 The information of SP proteins from different apiaceae species

1.5 序列分析

采用DNAMAN软件对获得的DcPS基因及其蛋白序列进行多重比对，利用该软件进行氨基酸酸碱统计和疏水/亲水性鉴定。利用SMART在线网站(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)进行氨基酸序列结构域分析[11]。

1.6 荧光定量PCR分析

根据胡萝卜DcPS基因克隆测序结果，结合胡萝卜基因组(GenBank: LNRQ00000000.1)和其对应的转录组数据，设计一对长度为179 bp特异的荧光定量引物(正向：5′- GTGTTCTTAGAGATCATCCAAGTAC-3′，反向：5′- GGTTGAAGATGTTGTATCAGTTCC -3′)。采用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒，按照说明书进行荧光定量PCR分析。体系为20 μL，其中荧光酶：10 μL，正向/反向引物：各0.4 μL，模板：2 μL，灭菌的ddH2O：7.2 μL。以胡萝卜ACTIN为内参基因[12]，正向为：5′- CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′；反向为：5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′，与目的基因一起扩增。荧光定量PCR程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸10 s，40个循环；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。相对定量，使用参照基因ΔCT法[13]，表达差异等于2-ΔCT，ΔCT= CT目标基因-CT actin。相对定量是基于处理和对照之间，目标基因对参考基因的表达量的比较。

1.7 数据分析

使用Microsoft Excel 2007进行定量数据和物质含量显著性分析，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜DcPS基因的克隆

克隆测序结果表明胡萝卜DcPS基因长度为1 518 bp，能够编码505 个氨基酸，属于细胞色素P450超级家族。其序列与胡萝卜基因组公布的序列(GenBank:XM_017393936.1)5′基本一致，但3′多27 bp(图1)，而与熊爱生教授课题组公布长度一致。其原因可能二者属于不同胡萝卜类型所致，其中基因组测序的胡萝卜为南特类型胡萝卜，而本研究所用的材料‘黑田五寸’为黑田类型胡萝卜。另外，从克隆得到的DcPS基因(GenBank: AY532370.2)与阿米芹PS基因基本一致(见图1)，两者序列一致性达80.4%。

2.2 胡萝卜DcPS基因编码的氨基酸序列分析

分析表明克隆得到的胡萝卜DcPS基因编码的氨基酸，其蛋白分子质量为57.10 kDa，等电点9.51，其亲水性强于疏水性，应属于亲水性蛋白(图2)。利用SMART在线网站对获得的胡萝卜DcPS氨基酸与经过验证的阿米芹PS氨基酸序列(GenBank:Q6QNI4.1)进行结构域预测，结构表明均含有1个跨膜区，所在的位置分别为：9～31和12～29。另外胡萝卜DcPS氨基酸序列还存在9个明显的结构特征(表2)。

图2 胡萝卜DcPS氨基酸序列亲水、疏水性预测Fig.2 Predicted hydrophilic and hydrophobic properties of carrot DcPS protein

2.3 胡萝卜DcPS进化分析

采用最大似然(Minimum likelihood，ML)方法构建胡萝卜DcPS进化树。结果表明胡萝卜与毒胡萝卜最接近，处在一个分枝上，阿米芹和珊瑚菜的2个PS均各处于各自分枝上。另外，中国起源的物种鸭儿芹和水芹，处在同一分枝中，而与非中国起源中心的物种，如欧防风、欧芹和旱芹等进化上具有一定的距离(图3)。暗示着可能起源同一中心的物种PS蛋白进化上较接近。

注：—：表示从各转录组数据中找到，但未在NCBI 上公布。图3 不同伞形科物种PS氨基酸的进化分析(Bootstrap：1000)Fig.3 The evolution analysis of PS amino acid sequences among different apiaceae species (Bootstrap：1000)

2.4 胡萝卜DcPS基因在肉质根发育过程中表达

分别取胡萝卜根膨大过程中的10 d、20 d、40 d、60 d、80 d和100 d样，利用荧光定量PCR检查其表达量。结果表明，胡萝卜补骨素合成酶基因DcPS，主要是在胡萝卜根膨大过程60 d及其以后，其中80 d达到最高，其后降低。60～80 d 是胡萝卜快速膨大时期，暗示着胡萝卜补骨素合成主要阶段与胡萝卜生长膨大阶段相关。另外，‘黑田五寸’胡萝卜商品期是在播种后90～110 d，即本研究的发芽后80～100 d，暗示着该阶段食用可能有更多的补骨素物质积累(图4)。

注：图中不同小写字母表示在芹菜发育过程无显著性(P<0.05)。图4 不同生长阶段胡萝卜根DcPS基因表达Fig.4 Expression levels of DcPS gene in carrot roots during different growth stages

3 讨论

胡萝卜按照来源，目前主要有以下几种类型：阿姆斯特丹(Amsterdam forein)、博力克姆类型(Berlicum)、南特类型(Nantes)、皇帝类型(Imperator)、黑田类型(Kuroda)、丹佛斯类型(Danvers)、弗拉克类型(Flakkee)、尚特奈类型(Changtenay)和牛心类型(Oxheart)[14]。其中黑田和南特类型为栽培面积最大的胡萝卜类型，而NCBI基因组数据库中测序的胡萝卜类型属于南特类型[15]，南京农业大学园艺学院熊爱生教授选用的胡萝卜测序材料属于黑田类型[16]，可能2种类型胡萝卜在基因数据中存在一些差异，如本研究中的DcPS基因。其余类型的胡萝卜，目前还未有或者未公布基因组数据，导致在分析胡萝卜分子进化时存在一定的不足。如本研究的胡萝卜DcPS基因来源以‘黑田五寸’cDNA为模板，克隆得到的序列长度与熊爱生教授公布的基因组一致。

近年来，补骨素物质成为老人强效补骨、强健骨质等增加骨质的保健药品之一，也是婴幼儿补骨药物之一。通过食用蔬菜获得更多的补骨素成分，减少对保健药品的食用，是目前开发蔬菜粮食作物的目标之一。若在胡萝卜肉质根中合成大量补骨素成分，必然能够增加老人和婴幼儿对骨质的要求。补骨素合成酶作为补骨素合成关键酶，在伞形科植物中该基因克隆长度在1 500 bp左右。该酶在珊瑚菜中分析表明了含有1个跨膜区[9]，且为亲水性蛋白，与对胡萝卜DcPS研究结果一致，表明该酶能够催化补骨素物质的生成。

利用现代分子生物信息能够初步了解胡萝卜体内是否能够合成具体的物质，即初步了解该物种是否含有物质合成的代谢途径。本研究初步对胡萝卜补骨素合成酶基因进行了克隆，其与同属于伞形科的药用植物阿米芹物种的该基因，具有很高的相似性，暗示着胡萝卜可能具有合成补骨素物质能力。下一步需利用生物数据库数据，将胡萝卜体内合成补骨素物质的完整代谢途径基因进行分析和验证，并利用高效液相色谱和核磁共振等设备验证胡萝卜中是否含有补骨素成分，为培育具有保健价值的胡萝卜新材料、新品种服务。