蒋文贤，何依蓉，陈梦婷，陈培富

（云南农业大学动物医学院，昆明 650201）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S.aureus）为葡萄球菌属中的主要致病种，其分布广泛，宿主种类众多，主要引起皮肤、黏膜受损或免疫力低下个体的化脓性感染或坏死性疾病，严重的可引起败血症，还可引起人中毒性疾病（食物中毒或中毒性休克）。据报道，原料牛乳的金黄色葡萄球菌检出率为20%～50%[1-7]；从羊、猪等动物皮肤脓肿分离到金黄色葡萄球菌的报道也不少；金黄色葡萄球菌引起的鸡败血症死亡率很高，但在现代养殖条件下该病已不多见[8-9]。金黄色葡萄球菌所致感染性疾病类型在不同种宿主常表现不同，在牛多为乳腺炎，在羊和猪多见皮肤脓肿，在鸡多见脐炎或败血症，提示该菌存在宿主种类及组织嗜性的差异。王伟等[10]提出金黄色葡萄球菌存在明显宿主种类差异的观点，并认为这主要由其携带的可移动遗传原件决定。为了解金黄色葡萄球菌形成宿主种类差异的病原学因素，本试验对分离自山羊皮肤脓肿、乳房炎奶牛乳汁和败血症鸡心包积液的3株金黄色葡萄球菌，做了一系列生物学特性比较研究。

1 材料与方法

1.1 材料脓汁采集自弥勒市某农户实施山地放牧的山羊群，该羊群近5年不断发生皮肤脓肿病，畜主做排脓治疗，虽未见发生死亡，但尝试使用多种药物注射治疗均未见有改善效果。中段牛乳采自陆良县某公司奶牛养殖基地患临床型乳房炎的奶牛。心包积液采自某高校实习鸡场病死数小时内的武定鸡。所有病料采集均使用一次性无菌注射器。雄性新西兰青年肉兔4只，分笼饲养；BALB/c小白鼠96只（雌、雄各半），均为健康动物。

1.2 分离培养分别将3个样品划线接种于含5%绵羊抗凝血的胰蛋白酶大豆胨（TSA）琼脂平板，37℃培养24 h，挑取单个菌落再做划线培养，直至形成外观形态完全一致的菌落，转种于Baird-Park琼脂和卵黄高盐琼脂，37℃培养24 h，观察细菌生长情况和菌落形态特征。

1.3 染色镜检及生化鉴定取少许细菌纯培养物，按革兰染色及荚膜染色试剂盒说明书染色镜检，同时按微量生化反应试剂盒说明书做细菌生化试验。

1.4 生长曲线测定将装有2 mL无菌LB液体培养基的9支EP管分为3组，每组分别接种10 μL相同OD550值的牛源、羊源和鸡源菌液；置于37℃恒温摇床水浴培养，每间隔2.5 h测定并记录OD550值。根据所测数据求OD550平均值，以时间为横坐标，OD550值为纵坐标绘制生长曲线。

1.5 药敏试验及耐药基因检测采用Kirby-Baue纸片扩散法进行药敏试验。使用天根细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，-20℃保存备用。采用PCR扩增检测β-内酰胺类耐药基因（BlaZ）及氨基糖苷类耐药基因aph（3'）-Ⅲ a。

1.6 分子生物学特性分析

1.6.1 引物设计及合成 据GenBank收录的参考序列，使用Primer Premier 6.0设计引物16S rRNA（GenBank：BX571857.1）、耐热核酸酶（Nuc）（GenBank：CP029080.1）和杀白细胞毒素（PVL）（GenBank：CP026957.1）；毒性休克毒素（Tst）、肠毒素（SEA～SEE）、β-内酰胺类耐药基因（BlaZ）、氨基糖苷类耐药基因（ant(4')-Ia、aac(6')-Ie/aph(2'')、aph(3')-IIIa）、随机扩增多态DNA（RAPD）（OLP6、OLP11、OLP13、4M、Primer 6）等引物参照文献[11-16]合成（表1）。

1.6.2 16S rRNA基因克隆测序分析 以16S rRNA通用引物做PCR扩增，胶回收扩增产物，插入pMD-18T载体，转化DH5α感受态大肠杆菌细胞，涂布于LB（Amp＋）固体培养基培养过夜，挑取3～5个菌落，提取质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，最后使用DNAMAN比对分析测序结果。

1.6.3 耐热核酸酶和毒力基因扩增分析 PCR扩增Nuc基因，按上述方法做克隆测序分析。使用引物PVL及Tst，PCR扩增检测毒力基因，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6.4 随机扩增多态DNA 使用随机扩增多态DNA引物，PCR扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 SDS-PAGE及Western blot检测蛋白将来自不同宿主的3个分离菌株悬液调整至相同吸光值及体积，与等体积2×SDS上样缓冲液混匀，煮沸10 min，离心取上清液，加于4.5%浓缩胶上样孔，经10%分离胶110 V电泳90 min，取分离胶做考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色；将凝胶置于转移槽中100 V转膜1 h，以10%脱脂奶粉溶液封闭NC膜2 h，依次加一抗（山羊血清）、二抗（HRP-兔抗羊）孵育，最后加入显色液显影，观察并记录结果。

表1 PCR扩增所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.8 免疫原性测定对兔子皮下注射3.95×109CFU细菌，两周后加强免疫一次，过7 d采血，分离并倍比稀释血清，采用平板凝集试验测定血清抗体凝集效价。

1.9 致病性试验离心细菌悬液，弃掉上清液，以生理盐水重悬沉淀。将90只小鼠随机平均分为3个大组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组），每个大组又随机分为3个小组，分别腹腔注射3×108、3×107和3×106CFU的羊源、牛源或鸡源细菌悬液，以腹腔注射0.3 mL灭菌生理盐水6只小鼠用作对照。每天观察2～3次，统计7 d内的发病与死亡情况，计算细菌对小鼠的半数致死量（median lethal dose, LD50）。

2 结果

2.1 培养结果在血琼脂平板上羊源、牛源、鸡源菌株分别形成纯白色、灰黄色和灰白色的圆形菌落（图1A，1B，1C）；出现β溶血时间分别为12、24、24 h；3个菌株在Baird-Parker琼脂上均为黑色“双环”菌落（图1D，1E，1F），在7.5%～15%盐浓度卵黄高盐琼脂平板上均能生长（图1G，1H，1I），盐浓度为25%时亦能生长，为白色圆形菌落，牛源菌株菌落较小；鸡源和牛源菌株在7.5%卵黄高盐琼脂平板上偶尔形成金黄色菌落，但经再次传代培养恢复为白色菌落。

图1 不同培养基上的菌落Fig.1 The colonies in different media

2.2 染色镜检结果各分离菌株革兰染色镜检均为紫色葡萄串状球菌（图2A，2B，2C），即为革兰阳性球菌；荚膜染色镜检均未见荚膜。

图2 染色镜检结果（1000×）Fig.2 The results of staining microscopy (1000×)

2.3 生化鉴定羊源菌株（Y）、牛源菌株（N）和鸡源菌株（J）蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、尿素、甘露醇、精氨酸、兔血浆凝固酶试验、甲基红试验、硝酸盐还原试验及触酶试验均为阳性，新生霉素生长试验均为阴性，符合金黄色葡萄球菌的生化特性，但甘露糖、蕈糖发酵试验及甲基红、二乙酰试验结果有差异（表2）。

表2 生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results

2.4 生长曲线及世代时间生长曲线显示，羊源菌株较牛源和鸡源菌株生长较快（图3），对数生长末期细菌数分别为3.52×109、2.46×109、1.83×109CFU/mL，世代时间分别为40、46、42 min。

图3 细菌生长曲线Fig.3 The Bacteria growth curves

2.5 分子生物学鉴定

2.5.1 16S rRNA基因克隆测序分析 16S rRNA基因PCR扩增产物及TA克隆质粒条带符合预期大小（图略）；测序与金黄色葡萄球菌16S rRNA相似度均达99%以上，绘制遗传进化树可知鸡源、牛源菌株同源性相近（图4）；3个菌株16S rRNA基因克隆序列长度分别为1477、1472、1472 bp，均存在位点差异，且羊源菌株比另两株在42 bp位置多4个A，在1281 bp位置多一个C（GenBank登录号：MT628393-MT628395）。

图4 分离菌株与参考菌株的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of isolated and reference strains

2.5.2 耐热核酸酶和毒力基因 3株菌耐热核酸酶基因（Nuc）PCR扩增产物测序比对结果符合预期大小。杀白细胞毒素毒力基因（PVL）检测结果：使用引物PVL1扩增，仅羊源菌株出现目的条带；使用引物PVL扩增，鸡源及牛源菌株均出现目的条带，表明3个分离菌株的PVL存在碱基序列差异。中毒性休克综合征毒素毒力基因（Tst）的检测均为阳性；但未扩增出肠毒素A～E（SaeA～E）目的条带。

2.5.3 RAPD检测结果 使用5条不同引物做PCR扩增，其中OLP6、OLP11、Primer6能有效将3株菌分为不同基因型，尤以OLP11扩增多态性显示3个菌株之间存在较大的遗传差异，具有较好的分型效果（图3）。

图5 3个菌株随机多态性基因扩增产物Fig.5 RAPD produts of 3 strains

2.6 药敏试验及耐药基因检测结果3个菌株耐药情况总体相似：对左氧氟沙星、头孢噻肟、利福平等药物高度敏感；对乙酰螺旋霉素、磺胺甲噁唑等中度敏感；对链霉素、林可霉素、氨苄西林、青霉素等耐药（表3）；且检出β-内酰胺类耐药基因Blaz和氨基糖苷类耐药基因aph(3')-IIIa。

表3 药敏试验部分结果Table 3 Partial results of drug susceptibility test

2.7 SDS-PAGE及Western blot结果3个菌株表达的蛋白质种类基本相同，但表达量有差异；牛源菌株黄色与白色菌落在分子量约38.5 kDa的蛋白质条带表达量差异较大（图6）。Western blot结果显示羊源菌株在28、36.5、45 kDa处出现特异性条带，其余两株菌无特异性条带出现（图7）。

图6 SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis

图7 Western blot分析Fig.7 Western blot analysis

2.8 免疫原性测定结果鸡源菌株（J）诱导兔产生的抗体效价最高，为27；羊源菌株（Y）与牛源菌株（N）诱导兔产生的抗体效价略低，为26。（表4）。

表4 免疫兔血清凝集抗体效价Table 4 The agglutinating antibody titers of immunized rabbits

2.9 致病性试验小鼠在注射高剂量菌液后表现出扎堆、颤抖现象，至96 h，羊源、牛源和鸡源菌株分别致死1只、5只和2只小鼠，死亡小鼠经剖检未见积液及脓肿；对照组（生理盐水）、中剂量和低剂量组均无小白鼠死亡。因未设置更高剂量组，未能测出3株菌的LD50。

3 讨论

3.1 分离菌株的培养特性差异本试验所获3个临床分离菌株培养及生化特性均符合金黄色葡萄球菌的基本特征，属于血浆凝固酶阳性、对新生霉素敏感的葡萄球菌群成员。但3个菌株在甘露糖、蕈糖利用及甲基红、二乙酰产生试验存在能力差异，表明这3株不同宿主来源的金黄色葡萄球菌存在代谢差异。本试验发现，羊源菌株的生化特性较接近牛源菌株，提示反刍动物来源的菌株具有某些生化特性的相似性。但牛源与鸡源菌株生长模式相似，而羊源菌株生长速度明显快于它们。羊源菌株产生β溶血的能力较强，可能是引起羊群患顽固性皮下脓肿的重要原因。此外，细菌小菌落突变株（SCVs）表型可能是该菌进行细胞内摄作用和在宿主细胞中生存的一种最佳策略[17]。

本试验还发现牛源菌株和鸡源菌株在卵黄高盐琼脂多数形成白色菌落，偶尔形成黄色菌落，表明其存在2个色素相。有学者发现该菌可产生葡萄球菌金黄色素（staphyloxanthin，STX），其化学本质为类胡萝卜素，可保护一些菌株免受嗜中性粒细胞的氧化杀伤[18]。国内外学者发现萘替芬（naftifine）和新型抑制剂NP16都能通过竞争抑制该色素合成的关键催化酶（CrtN），而降低金黄色葡萄球菌的致病力[19-20]，提示色素产生与毒力有关，调控STX分泌的基因CrtN已成为新的治疗靶点。STX的产生不仅受基因的调控，还受其他因素影响，如柠檬酸循环参与色素调控机制，而不同培养条件又可影响柠檬酸循环。总之，金黄色葡萄球菌菌落颜色的转变机理及其联系的致病意义，尚不完全清楚。

3.2 分离菌株的遗传及基因表达差异16S rRNA基因序列分析显示，羊源菌株较其他两株多5个核苷酸，其中4个核苷酸集中分布，这可能是有利于rRNA高效表达和核糖体合成蛋白质，从而促进细菌快速生长的一种变异。三者的Nuc基因片段未见序列差异，表明该基因高度保守。本试验RAPD结果显示，3个菌株指纹图谱存在众多差异，表明金黄色葡萄球菌存在丰富的基因多态性，是引起不同菌株生长培养特性和致病性存在差异的根本原因[16]。本试验发现以OLP11为引物，扩增产物最能显示3株细菌之间的基因组差异，提示应用该引物可对广泛来源的金黄色葡萄球菌快速进行基因分型。遗传进化分析显示，牛源与鸡源菌株非常相近，而羊源菌株与它们相距较远，这与16S rRNA基因差异情况吻合。近来有研究发现，通常扮演机会致病菌的金黄色葡萄球菌，其宿主差异主要由基因组携带的可移动遗传原件决定[10]。这与RAPD分型显示不同宿主来源的菌株之间存在基因差异大体相符。

SDS-PAGE分析未见3个菌株存在蛋白质表达种类的显著差异，可能与考马斯亮蓝染色法灵敏度不高有关。但Western blot显示羊源菌株表达能诱导宿主动物产生良好免疫应答的3个蛋白质成分，而在鸡源和牛源菌株未见这些蛋白质。本试验还发现，牛源菌株黄色与白色菌落在分子量约38.5 kDa的蛋白质条带表达量差异较大，提示该蛋白质可能与色素表达有关。但我们未检测到肠毒素基因及其蛋白质，提示引起食物中毒的菌株与引起感染的菌株可能存在基因种类的差异。将来通过基因组比较分析，有望解释该菌菌株之间的差异来源。

3.3 分离菌株的多重耐药性本试验所用菌株分离自奶牛、山羊和鸡的不同组织样品，表明该菌能够在特定条件下进入不同宿主体内，并在不同部位定植。我国牛源金黄色葡萄球菌多呈现多重耐药，且易发生耐药性变异[21]。尤其耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的临床感染让人担心无药可用[5-7]。本试验发现，3个菌株都表现出对青霉素类、链霉素及林可霉素的多重耐药性，其中牛源菌株对氨基糖苷类耐药性尤为突出，可能与我们发现奶牛场经常使用该类药物治疗乳房炎等疾病有很大的关系，即发挥了选择作用。由于现代养殖环境已有明显改善，鸡群死于金黄色葡萄球菌相关的败血症现已少见，但本试验从败血症病死鸡的心包液分离到该菌，可能是因为病死个体免疫力低下，这与我们发现采集样品的鸡场存在较高比例的马立克病毒感染的调查结果一致。总体看来，加强控制养殖环境卫生和免疫抑制疾病，对防范多重耐药性金黄色葡萄球菌的危害具有生产意义。