廖星合，刘占涛，刘明辉

1.复旦大学附属肿瘤医院综合治疗科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.广东省人民医院赣州医院（赣州市立医院）神经外科，江西 赣州 341000

脑胶质瘤是原发性脑瘤中发病率最高的肿瘤，因其独特的生物学特性［1-2］导致患者治疗难度大、致残和致死率高及预后差［3-4］。因此，探索新的诊断标志物和治疗方法显得极其重要和紧 迫。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在脑胶质瘤的发生和发展过程中发挥着重要作用［5-6］。目前已经发现HOXA集群反义RNA2（HOXA-AS2）与胶质瘤相关［7-8］。然而HOXA-AS2调节胶质瘤细胞增殖的机制仍不清楚。肿瘤干细胞样细胞（cancer stem-like cell，CSC）具有自我更新和形成大块肿瘤的能力［9-10］。CSC与非CSC可以互相转化［11］，既往研究已经发现lncRNA参与了这一过程［12］。然而目前HOXA-AS2与胶质瘤干细胞（glioma stem cell，GSC）的关系尚未确定。外泌体可以通过传递细胞内的物质（包括蛋白质、DNA、miRNA、lncRNA和mRNA）来介导细胞间的相互作用［13］。此外，肿瘤源性外泌体与肿瘤发生及肿瘤微环境有关［14］。然而，含有HOXA-AS2的GSC来源外泌体是否对胶质瘤细胞增殖、迁移和干细胞特性有影响尚不清楚。因此，本研究对上述问题进行探究。

1 材料和方法

1.1 细胞培养和实验试剂

人皮质星形胶质细胞系HA1800、人胶质瘤细胞系T98G、SHG44、U251MG和HEK-293T细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM培养基、TRIzol®试剂、免疫磁珠分选试剂盒、RIPA缓冲液、ECL检测试剂、死亡细胞凋亡试剂盒、Step-One Plus实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）系统均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。EntiLinkTM第1链cDNA试剂盒、EnTurboTMSYBRGreen PCR SuperMix系统购自武汉科鹿生物科技有限公司。FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司。CD133兔单抗（1∶1 000）、SOX2兔单抗（1∶1 000）、OCT4兔单抗（1∶1 000）、cleaved caspase 3兔单抗（1∶1 000），CD9兔单抗（1∶1 000）、CD63兔单抗（1∶1 000）、CD81兔单抗（1∶1 000）、TSG101兔单抗（1∶1 000）和β-actin小鼠单抗（1∶1 000）等所有一抗和相应二抗均购自英国Abcam公司。PKH26细胞膜染料、transwell小室购自美国Merck公司。pLVX-IRES-PURO HOXA-AS2慢病毒质粒和含靶向HOXA-AS2质粒购自美国克隆泰克实验室。细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）购自上海碧云天生物技术研究所。Cell-Light EdU Apollo567体外试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。

1.2 临床数据获取

从中国脑胶质瘤基因组图谱（the Chinese Glioma Genome Altas，CGGA; http://www.cgga.org.cn）和癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/）数据库下载了包含低级别脑胶质瘤（low-grade glioma，LGG）和高级别脑胶质瘤（high-grade glioma，HGG）lncRNA的表达数据。本研究从CGGA数据库中选取312例患者信息，从TCGA数据库中选取975例患者信息，包括性别、年龄、生存时间及lncRNA表达情况等。

1.3 方法

1.3.1 识别差异表达lncRNA（differentially expressed lncRNA，DelncRNA）

从CGGA和TCGA数据库下载了包含LGG和HGG lncRNA表达数据的数据集。用R语言识别LGG和HGG组织之间的DelncRNA。调整后P＜0.05和|log2（差异倍数）|＞2的lncRNA认定为DelncRNA。使用维恩图包对来自两个数据集（CGGA和TCGA）的重叠DelncRNA进行了识别。此外，我们通过CGGA和TCGA数据集来确定HOXA-AS2水平与胶质瘤患者总生存期（overall survival，OS）之间的关系。

1.3.2 细胞培养

人皮质星形胶质细胞系HA1800，人胶质瘤细胞系T98G、SHG44、U251MG和HEK-293T细胞在含10%FBS的DMEM培养基中培养，细胞均在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。

1.3.3 RTFQ-PCR检测

使用TRIzol®试剂分离出总RNA，再使用EntiLink™第1链cDNA试剂盒合成cDNA，然后使用EnTurbo™SYBR-Green PCR SuperMix和Step-One Plus RTFQ-PCR系统进行RTFQPCR。温度条件如下：在95 ℃预温育3 min，然后在95 ℃温育10 s，58 ℃温育30 s，72 ℃温育30 s，循环40次。以β-actin作为lncRNA HOXAAS2的内参照物。使用标准2-ΔΔCq方法计算表达水平。引物序列如下：β-actin有义链为5’-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3’，反义链为5’-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3’；HOXA - AS2有义链为5 ’ -GGAAGGACACGTTTCTATGCC-3’，反义链为5’-ACTTGGATTCTGACGGCTCAC-3’。

1.3.4 流式细胞术筛选GSC

在本研究中，我们使用FACS Calibur流式细胞仪和之前描述的免疫磁珠分选试剂盒分选CD133+细胞。SHG44细胞在DMEM/F12培养基［包括碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）］中培养，在37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。细胞与CD133抗体珠复合物一起温育，之后再加入分选液重新悬浮细胞，洗脱CD133+细胞，随后将分离的CD133+细胞加入CD133-PE抗体，用流式细胞仪进行分选。

1.3.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测

利用RIPA缓冲液裂解细胞以获得蛋白质，用二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白质浓度，蛋白质（30 μg/lane）用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶分离，转移到PVDF膜（美国Millipore公司）上，然后用5%脱脂牛奶在含有吐温-20三乙醇胺缓冲盐溶液（trisbuffered saline Tween，TBST）中堵塞膜。随后将膜与一抗在4 ℃下温育过夜，然后与相应的二抗（1∶5 000）在室温下温育。ECL检测试剂用于检测蛋白带。所用的一抗如下：CD133兔单抗（1∶1 000，货号397903，Biolegend），SOX2兔单抗（1∶1 000，货号ab92494）、OCT4兔单抗（1∶1 000，货号ab19857）、TSG101兔单抗（1∶1 000，货号ab125011）购自英国Abcam公司，cleaved caspase 3兔单抗（1∶1 000，货号AF7022）、CD63兔单抗（1∶1 000，货号AF5117）购自美国Affbiotech公司，CD9兔单抗（1∶1 000，货号20597-1-AP）、CD81兔单抗（1∶1 000，货号27855-1-AP）购自美国Proteintech公司，β-actin兔单抗（1∶1 000，货号TDY051）购自天德悦（北京）生物科技有限责任公司。以β-actin作为对照。

1.3.6 外泌体的分离和表征

从GSC 中收集上清液，使用超离心法分离外泌体，用BCA 法测定外泌体蛋白浓度，外泌体的识别使用纳米粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）和透射电镜（transmission electron microscope，TEM）测 定。

1.3.7 外泌体摄取

从GSC中提取的外泌体（20 μg）用PKH26细胞膜染料进行荧光标记，胶质瘤细胞与荧光标记的外泌体共培养48 h，使用荧光显微镜观察胶质瘤细胞外泌体的内化情况。

1.3.8 共培养系统

用Cy3标记的HOXA-AS2转染SHG44-GSC，转染的SHG44-GSC接种于transwell®聚酯透性支架上，SHG44细胞接种于下层腔室，温育24 h后，用共聚焦显微镜对SHG44细胞成像。

1.3.9 慢病毒转染

获取pLVX-IRES-PURO HOXA-AS2慢病毒质粒和含靶向HOXA-AS2质粒的慢病毒shRNA后，用慢病毒质粒和包装质粒（pLP/VSVG、pLP1和pLP2）转染HEK-293T细胞72 h，然后收集含病毒的上清液，将适量的慢病毒转导至细胞内72 h。

1.3.10 CCK-8检测

在相应处理后，胶质瘤细胞被接种到96孔板（5 000个细胞/孔）中，37 °C培养48 h，随后将CCK-8试剂10 μL分别加入孔中，37 °C温育2 h，然后使用酶标仪在450 nm处对每个孔的吸光度（D）进行评估。

1.3.11 5-乙炔基-2'-嘧啶核苷（EdU）染色

使用Cell-Light EdU Apollo567体外试剂盒测定细胞增殖，细胞用50 μmol/L EdU温育后，用Apollo染料溶液染色，随后使用荧光显微镜观察EdU阳性细胞。

1.3.12 Transwell小室分析

使用孔径为8 μm的transwell小室分析细胞迁移和侵袭能力，将细胞（1×105）重悬浮于200 μL无血清培养液中，加入上室，下室填充含10%FBS的DMEM（700 μL），温育24 h后，用1%结晶紫对下膜表面的细胞进行30 min的染色，随后用荧光显微镜（购自日本Olympus公司）捕获染色细胞，侵袭实验的条件与迁移实验相同，但transwell板的上室用人工基底膜预覆盖。

1.3.13 细胞凋亡检测

细胞凋亡的检测使用细胞凋亡试剂盒。细胞与Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（propidium iodide，PI）在暗室中温育30 min，然后用流式细胞术检测细胞凋亡。

1.4 统计学处理

数据统计分析采用SPSS 22.0及R 4.0.1软件。两组之间的比较用非配对Student’st检验进行分析，多组间比较采用单因素方差分析和Tukey事后检测法。连续性变量数据以±s表示。使用COX回归分析计算风险比（hazard ratio，HR）。采用双侧检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胶质瘤中DelncRNA的识别

从CGGA数据集中鉴定出312个DelncRNA（图1A），并从TCGA数据集中鉴定出975个DelncRNA（图1B）。在两个数据集中识别了11个重叠的DelncRNA，包括RP11-366L20.2、HOXB-AS1、RP4-792G4.2、RP11-93B14.5、HOTAIRM1、AC002454.1、CRNDE、RP11-834C11.5、HOXA-AS2、AGAP2-AS1和CTD-3049M7.1，并用维恩图表示（图1C）。在CGGA和TCGA数据集中，胶质瘤患者中高水平的HOXA-AS2与较差的OS相关（图1D～E，P均＜0.01）。此外，我们发现与HA1800细胞相比，T98G、SHG44和U251 MG细胞中HOXA-AS2的表达量更高（HA1800vsT98G：HR = -1.690，95% CI：-2.259 ～ -1.121，P＜0.000 1；HA1800vsSHG44：HR = -3.430，95% CI：-3.999 ～ -2.861，P＜0.000 1；HA1800vsU251MG：HR = -0.961，95%CI：- 1.530 ～ -0.392，P＜0.01，图1F）。上述结果表明HOXA-AS2在胶质瘤中表达升高，并且与OS呈负相关。

图1 胶质瘤中DelncRNA的识别Fig.1 Identification of DElncRNAs in glioma

2.2 HOXA-AS2在GSC中表达上调

本研究发现，SHG44-GSC中CD133 + 细胞的比例明显高于SHG44 细胞（8 1.6%v s23.8%；HR = 0.988，95% CI：53.63 ～ 73.04，P＜0.000 1，图2A）。此外，与亲代SHG44细胞相比，SHG44-GSC中CD133（HR = -0.520，95%CI：-0.717 6 ～ -0.321 8，P＜0.000 1）、SOX2（HR = -0.482，95% CI：-0.479 4 ～ -0.283 6，P＜0.000 1）和OCT4（HR = -0.466，95%CI：- 0.664 3 ～ -0.268 5，P＜0.000 1）的表达水平明显升高（图2B）。而且，HOXA-AS2水平在SHG44-GSC中也显著升高（图2C；HR = 0.996，95% CI：2.377 ～ 2.833，P＜0.000 1）。

2.3 SHG44-GSC通过外泌体将HOXA-AS2转移到SHG44细胞

SHG44-GSC衍生的外泌体呈圆形和杯状，直径50 ～ 150 nm，表达外泌体标志物CD9、CD63、CD81和TSG101（图3A～3B）。此外，本研究发现PKH26标记的外泌体被SHG44细胞吸收（图3C）。本研究还发现在SHG44细胞中观察到Cy3标记的HOXA-AS2（图3D）。

本研究发现，HOXA-AS2 OE转染的SHG44-GSC细胞（SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE）和SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE衍生的外泌体（SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE-Exo）中HOXA-AS2水平显著升高（P＜0.01，图4A、4B和4C）。然而，在HOXA-AS2 shRNA1转染的SHG44-GSC 细胞（SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1）和来自SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1 （SHG44-GSC/HOXAAS2 shRNA1-Exo）的外泌体中该水平却下降。在与SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE细胞共培养的SHG44细胞中，HOXA-AS2水平显著升高，而与SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1共培养的SHG44细胞则表现出相反的结果（P＜0.01，图4D）。抑制SHG44-GSC释放外泌体后，SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE或SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1对SHG44细胞中HOXAAS2水平没有影响（P＞0.05，图4E）。SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE-Exo增加了SHG44细胞中HOXA-AS2的水平（HR = -2.723，95%CI：- 2.920 ～ -2.526，P＜0.000 1），而SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1-Exo则显示出相反的结果（HR = 0.648，95% CI：0.450 5 ～ 0.844 8，P＜0.000 1，图4F）。

图2 HOXA-AS2在GSC中表达上调Fig.2 HOXA-AS2 is upregulated in GSC

图3 外泌体颗粒表征Fig.3 Characterization of exosomal particles

2.4 SHG44-GSC来源的外泌体转染HOXAAS2促进胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞特性

本研究发现SHG44-GSC/HOXA-AS2OE-Exo显著促进SHG44细胞增殖、迁移和侵袭（P＜0.01），而SHG44-GSC/HOXAAS2 shRNA1-Exo则对SHG44细胞增殖、迁移和侵袭无明显影响（图5A、5B和5C）。此外，SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1-Exo显著诱导SHG44细胞凋亡（P＜0.01，图5D）。另外Western blot检测结果显示，SHG44-GSC/HOXA-AS2 OE-Exo显著降低SHG44细胞中cleaved caspase-3的表达，而SHG44-GSC/HOXA-AS2 shRNA1-Exo则表现出相反的结果（P＜0.01，图5E）。

图4 SHG44-GSC通过外泌体将HOXA-AS2转移到SHG44细胞Fig.4 SHG44-GSC transfer HOXA-AS2 to SHG44 cells by exosomes

3 讨 论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，由于胶质瘤的增殖能力极强，具有高度浸润性，导致患者的预后极差，其中HGG患者的中位生存时间仅有13个月［15］。因此进一步明确与胶质瘤侵袭的相关分子机制十分重要。随着分子生物学的发展，分子靶向治疗逐渐成为胶质瘤治疗的新方法，找到特异性的生物标志物是胶质瘤靶向治疗的关键［16］。

lncRNA是一组长度＞200个核苷酸的非编码RNA［17］，HOXA-AS2是lncRNA的一种，位于人染色体7p15.2，属于HOXA簇成员，以往研究发现HOXA-AS2可通过结合组蛋白去甲基酶1，使染色质发生重塑，从而影响肿瘤细胞增殖与侵袭［18］。既往的研究表明，过表达的HOXA-AS2可以促进视网膜母细胞瘤［19］、胰腺癌［20］、胆囊癌［21］细胞增殖、迁移和侵袭。目前有关HOXA-AS2在脑胶质瘤中的相关研究较少，虽然俞盛健等［22］通过建立风险模型发现HOXAAS2可能是脑胶质瘤的预后风险lncRNA，但是并没有经过实验验证。本研究首次运用TCGA及CGGA 数据库找到HOXA-AS2 为共同的DelncRNA，并分析其表达情况，结果表明，高表达的HOXA-AS2与较差的OS相关，接着我们发现在胶质瘤细胞SHG44中的HOXA-AS2表达量明显高于HA1800细胞，此结果表明HOXA-AS2在胶质瘤中高表达，且与较差的患者预后相关。但其具体机制不清楚，有学者［23］认为HOXAAS2可通过表观遗传学介导Rho家族GTPase3的表达从而促进脑胶质瘤细胞的侵袭，也有学者［24］认为HOXA-AS2可通过microRNA（miRNA/miR）-373/EGFR轴促进胶质瘤的发展。

图5 SHG44-GSC来源的外泌体转染HOXA-AS2促进SHG44细胞的增殖、迁移、侵袭Fig.5 HOXA-AS2 transferred by SHG44-GSC-derived exosomes promoted proliferation, migration, invasion of SHG44 cells

肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力，既往研究已经发现lncRNA参与了这一过程，如lncRNA H19的下调已被证明可以抑制胶质瘤细胞的致瘤性和干性［12］，然而目前HOXAAS2与GSC的关系在之前尚未确定，在本研究中，我们从SHG44细胞中分离GSC，用流式细胞术检测CD133+富集的细胞，发现SHG44-GSC中CD133+细胞的比例明显高于SHG44。并利用Western blot检测干细胞相关蛋白CD133、SOX2和OCT4的表达水平，发现SHG44-GSC中的上述干细胞相关蛋白表达水平较SHG44中高。并且HOXA-AS2在SHG44-GSC中的表达量也明显高于SHG44。说明lncRNA HOXA-AS2增强了胶质瘤的干细胞特性。

外泌体是大小为40 ～ 160 nm的细胞外囊泡，通过传递细胞内的lncRNA来介导细胞间的相互作用［25］。相关研究已证实外泌体在细胞之间传递lncRNA的作用，如CSC和非CSC［26-27］。以往研究已证实CSC可启动肿瘤生成，并促进多种人癌细胞侵袭和干细胞生长［28-30］。既往研究［31-32］表明，外泌体lncRNA在包括胶质瘤在内的许多癌症的发展中发挥着重要作用，与肿瘤的侵袭、转移等关系密切。Jiang等［33］指出GSC衍生的外泌体miR-944可抑制胶质瘤细胞生长和血管生成，且Conigliaro等［34］证实来自CSC样CD90+细胞的外泌体lncRNA H19可促进内皮细胞的血管生成。另外，Sun等［35］发现GSC衍生的外泌体促进胶质瘤细胞增殖和干细胞特性。本研究首先分离出SHG44-GSC衍生的外泌体，接着用PKH26染液标记，发现标记的外泌体被SHG44细胞吸收，接着将转染了Cy3标记的HOXA-AS2的SHG44-GSC与SHG44细胞间接共培养，结果发现在SHG44细胞中观察到Cy3标记的HOXAAS2。表明HOXA-AS2可通过外泌体从SHG44-GSC转移到SHG44细胞，且通过CCK-8检测及transwell法我们发现SHG44-GSC/HOXA-AS2 OEExo可显著促进SHG44细胞增殖、迁移和侵袭。

综上所述，本研究从组织表达、患者预后和细胞多个层面探究了来自SHG44-GSC的外泌体HOXA-AS2在胶质瘤细胞中的作用，发现其表达量升高，且与患者不良预后相关，可显著促进胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞特性，提示HOXA-AS2可能是脑胶质瘤潜在的治疗靶点。但是本研究也有局限性，所以下一步可构建动物模型进行体内验证，并探索下游信号转导通路，以期在此基础上研发相应的小分子药物应用于临床。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。