刘泽文，袁芳艳，刘 威，高 婷，周丹娜，杨克礼，郭 锐，李 畅，田永祥

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，武汉 430064）

仔猪C 型产气荚膜梭菌病又叫仔猪红痢，是由C 型产气荚膜梭菌引起的初生仔猪急性传染病［1］，该病主要发生于3日龄以内的新生仔猪，主要临床表现为排出浅红或红褐色稀粪，发病急剧，病程短促，发病率可达40%～50%，死亡率可高达100%。由于该病发病急、死亡快，疫苗免疫预防是防治该病的最好办法之一。研究表明，将C 型产气荚膜梭菌外毒素抗原经过脱毒、灭活，然后制成灭活疫苗，免疫昆明小鼠和家兔后，用产气荚膜梭菌毒素对其进行攻毒，结果显示灭活疫苗具有良好的免疫效果［2］。为研制仔猪C 型产气荚膜梭菌病灭活疫苗，必须建立C 型产气荚膜梭菌生产用菌种种子批。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 C 型产气荚膜梭菌C59-2 第2 代基础种子，定义为F0代，作为原始种子，由中国兽医药品监察所保存和供应。

1.1.2 培养基及试剂 普通肉汤、厌气肉肝汤、肉肝胃酶消化汤、普通琼脂斜面、石蕊牛乳、葡萄糖鲜血琼脂、厌氧菌糖发酵管、生化试验管及相关试剂，均购自青岛海博生物技术有限公司。产气荚膜梭菌A、B、C、D 定型血清，均由中国兽医药品监察所提供。C 型产气荚膜梭菌冻干毒素（批号2007D），由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所制备、鉴定和保存。

1.1.3 试验动物 16～20 g 昆明小鼠，购自湖北省实验动物研究中心；怀孕69～74日母猪（C 型产气荚膜梭菌毒素中和抗体阴性）10 头，均来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所试验猪场。

1.2 基础种子的制备及保存

将第2 代基础种子（作为F0代菌种），分别接种改良厌气肉肝汤小管，37 ℃静置培养16～20 h，再移植500 mL 肉肝胃酶消化汤，36～37 ℃培养16～20 h，培养完成后，分别取样进行纯粹检验，3 000 r/min 离心30 min，收集沉淀加脱脂牛奶保护剂，混合均匀，定量分装（1 mL/支）进行冻干，作为基础种子1 代（记作F1）。同时，取离心上清测定毒素含量，连续传代至第F13代，共制备冻干菌种13 代，冻干菌种置于2～8 ℃保存。

1.3 种子批的鉴定

种子批建立后，分别取F1、F5、F10、F13代基础种子进行了鉴定。

1.3.1 纯粹检验 冻干菌种用普通肉汤复溶，分别接种普通琼脂斜面、普通肉汤、厌气肉肝汤、石蕊牛乳各2 管，每管0.2 mL，培养48 h，判定结果。

1.3.2 形态、染色特性 取24 h 厌气肉肝汤培养物，进行革兰氏染色，观察染色特性和菌体形态。

1.3.3 培养特性鉴定 取厌气肉肝汤培养物，划线接种葡萄糖鲜血琼脂，厌氧培养24 h，观察菌落形态和溶血特性。

1.3.4 生化特性鉴定 取厌气肉肝汤培养物，移植1 次，分别接种厌氧菌生化培养管，每管0.2 mL，37 ℃培养7 d，观察结果。

1.3.5 产毒素能力的测定 取厌气肉肝汤培养物按1%接种量接种肉肝胃酶消化汤，35～36 ℃静置培养16～20 h，离心后取上清液，用生理盐水将毒素上清液进行不同倍数的浓度稀释。取稀释好的毒素稀释液分别尾静脉注射16～20 g昆明小鼠，每个稀释度注射2 只，200 μL/只，观察24 h。根据小鼠的死亡情况计算上清液中含有的小鼠最小致死剂量（MLD/mL）。待测毒素含量（MLD/mL）=小鼠2/2 死亡的毒素最高稀释倍数×5。

1.3.6 血清型鉴定 用产气荚膜梭菌定型血清，以毒素抗毒素中和试验进行血清型定型。根据毒力测定结果，将培养上清稀释成50 MLD/mL，分别与A、B、C、D 定型血清等量混合，37 ℃作用30 min，静脉注射小鼠，观察24 h，同时设注射2 MLD 毒素的小鼠作为对照。

1.3.7 免疫原性鉴定 将F1、F5、F10、F13代菌种按1%接种量分别接种肉肝胃酶消化汤，35～36 ℃静置培养16～20 h 后，取样进行纯粹检验，并离心取上清测定毒素含量，同时加入终浓度为0.4%甲醛溶液，37 ℃灭活脱毒。取灭活脱毒菌液与20%氢氧化铝胶按5∶1 混合，制成疫苗（以脱毒前计算毒素含量，为2 000 MLD/mL）。经检验合格后，免疫怀孕母猪2头，于产前40～45日和15～20日各免疫1 次，每头肌肉注射疫苗2 mL/次，同时设未免疫母猪2 头作为对照。用免疫母猪所产1日龄仔猪5 头，连同对照母猪所产1日龄仔猪5 头，各耳静脉注射最小致死剂量的C 型产气荚膜梭菌毒素（35 MLD），连续观察14日，对照仔猪应全部死亡，免疫母猪所产仔猪应不低于4 头保护。

2 结果与分析

2.1 纯粹检验和形态观察

各代菌种均在厌气肉肝汤中生长较快，37 ℃培养16～20 h 后，呈均匀浑浊并大量产气，在石蕊牛乳中呈爆性发酵，普通肉汤中能生长，普通琼脂斜面上不能生长。革兰氏染色为阳性大杆菌，菌体两端钝圆，有荚膜，表明菌种纯粹，菌体形态及染色特性符合C 型产气荚膜梭菌特征。

2.2 培养特性

各代菌种在葡萄糖鲜血琼脂上培养24 h，形成灰白色，半透明表面光滑、边缘整齐的圆形菌落，菌落直径1～2 mm，菌落周围形成α、β 双环溶血圈。

2.3 生化特性鉴定

取F1、F5、F10、F13代菌种进行生化特性鉴定，各代次菌株均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、果糖、半乳糖，不发酵甘露醇、鼠李糖，靛基质、M-R 和V-P 试验呈阴性，生化特性均符合C 型产气荚膜梭菌特性［3］，具体结果见表1。

表1 菌种生化特性鉴定结果

2.4 产毒素能力的测定

对F1、F5、F10、F13代菌种的产毒系能力进行鉴定，结果各代次肉肝胃酶消化汤37 ℃培养16～20 h培养后菌液离心取上清液，各代次所产毒素含量分别为667、1 000、800 和800 MLD/mL，结果见2。

表2 菌种产毒素能力测定结果

2.5 血清型鉴定

取F1、F5、F10、F13代菌种肉肝胃酶消化汤培养物离心上清液，利用产气荚膜梭菌定型血清进行中和试验，确定菌株的血清型，结果各代菌种的培养上清均可被B、C 定型血清中和，而不被A、D 型血清中和，表明菌种的血清型为C 型，未发生变化，符合该菌株的血清型特性。

2.6 免疫原性鉴定结果

用F1、F5、F10、F13代菌种所制备的疫苗免疫母猪后，对其所产1日龄仔猪攻毒，对照母猪所产仔猪全部死亡，免疫母猪所产仔猪攻毒保护率均不低于4/5，结果见表3，表明各代种子批菌种的免疫原性均良好。

表3 菌种免疫原性鉴定结果

3 结论与讨论

产气荚膜梭菌是一类革兰氏阳性、严格厌氧，有芽孢的杆菌，可以引起多种动物，包括仔猪、鸡、牛和家兔等动物发病［4-10］。仔猪红痢主要是由C 型产气荚膜梭菌引起，产气荚膜梭菌产生的主要毒素包括α、β、ε 和ι 等，可以将产气荚膜梭菌分为A 型、B 型、C 型、D 型和E 型产气荚膜梭菌［4］。仔猪红痢是由C型产气荚膜梭菌引起的初生仔猪（3日龄以内）高度致死性肠毒血症，已排除红色粪便，小肠黏膜弥漫性出血和坏死为特征［11］。该病一旦发生，病程短、死亡率高，即使通过药物治疗有一定疗效，病猪仍会由于肠道的严重损伤而死亡，因此该病的预防比治疗显得更为重要。将仔猪红痢灭活疫苗［12］免疫妊娠母猪，是新生仔猪通过吮吸母乳而获得被动免疫而产生保护力。

为研制仔猪大肠杆菌病、C 型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗，为仔猪红痢的免疫预防提供产品支持，必须建立C 型产气荚膜梭菌生产种子批。本研究将C 型产气荚膜梭菌C59-2 经连续传代建立了基础种子批，选取其中的F1、F5、F10、F13代菌种进行鉴定，表明各代菌种均纯粹，培养特性、生化特性、血清学特性均符合C 型产气荚膜梭菌C59-2 菌株的特征；每代产毒素能力均在600～1 000 MLD/mL 之间，通过毒素浓缩，完全可以达到二联疫苗的配苗要求，用F1、F5、F10、F13代菌种所制备的疫苗免疫怀孕母猪后，对其所产1日龄仔猪进行攻毒，对照母猪所产仔猪全部死亡，免疫母猪所产仔猪攻毒保护率均不低于4/5，表明各代种子批菌种的免疫原性均良好。因此，建立的种子批可用于仔猪大肠杆菌病、C 型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的生产和检验，为保证疫苗的质量，将基础种子批的代次确定为F1～F10。