朱紫晴 黄守龙 张学胜 汪 梅 王 宁 李玉成

(安徽大学资源与环境工程学院，安徽 合肥 230601)

多氯代二苯并噻吩(PCDTs)是含硫“类二噁英”化合物，疏水性高，在环境中可长期存在，易在生物体内富集并产生毒性效应[1-2]。

PCDTs主要产生于城市垃圾和危险废物焚烧、冶金和金属回收的高温过程、制造多氯联苯和三氯苯磺酸盐的过程[3-5]。PCDTs已在河湖沉积物、造纸废水、垃圾焚烧飞灰和水生生物等环境样品中检出[6]。BUSER等[7]在瑞士焚烧飞灰中测得PCDTs总质量浓度为55 ng/g，其中2,3,7,8-四氯代二苯并噻吩(2,3,7,8-TCDT)质量浓度达到35 ng/g；BUSER等[8]在美国的螃蟹和龙虾中测得2,3,7,8-TCDT质量浓度分别为8.3、1.0 ng/g。可以发现，2,3,7,8-TCDT是PCDTs中检出浓度较高的化合物。

KOPPONEN等[9]发现，2,3,7,8-TCDT对大鼠肝脏癌细胞有内分泌干扰作用。MANTYLA等[10]发现，2,3,7,8-TCDT对小鼠肝脏正常细胞也有内分泌干扰作用。NAKAI等[11-12]通过免疫分析也证实了2,3,7,8-TCDT的内分泌干扰作用。由于水是生命之源，水生生物相比陆地生物更易暴露于水中溶解的污染物下，但对于2,3,7,8-TCDT在水生生物体内的毒性研究相对较少。

锦鲫(Carassiusauratus)，一种典型淡水鱼，在中国普遍存在，易于获得，实验室内驯养简单，因此是一种理想的水生生物毒理学研究实验动物[13-15]。肝脏是锦鲫体内最主要的代谢器官，对外源污染物反应灵敏，被认为是研究氧化损伤的最佳器官[16-18]。机体氧化损伤可以通过抗氧化酶(包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等)的活力变化来体现[19]。SOD和CAT是对抗氧化损伤的第一道防线，SOD可以催化活性氧自由基(ROS)转变为水和过氧化氢，CAT能分解过氧化氢生成水和氧气[20]。GPx属于第二道防线，在细胞代谢和自由基清除中发挥关键作用[21]。另外，当细胞受到ROS攻击时，会产生脂质过氧化而引起细胞功能的紊乱，因此脂质过氧化物的降解产物丙二醛(MDA)也常被用于生物体氧化损伤的评估[22]。

本研究首先探究了锦鲫不同组织(肌肉、鳃和肝脏)中的2,3,7,8-TCDT生物富集规律，在得出肝脏富集能力最强的情况下又对不同剂量的2,3,7,8-TCDT氧化损伤锦鲫肝脏的影响进行了研究。

1 材料与方法

实验锦鲫经过安徽大学实验动物伦理与管理委员会审核批准(批准号：2020-026)。实验用鱼无明显的疾病和肉眼可见的畸形。实验前，锦鲫需在室内驯养1周，每天定时喂食一次，并持续充氧。实验用水为活性炭去氯的曝气自来水。

1.1 锦鲫不同组织的生物富集实验

以50 L实验用水作为锦鲫的生存环境，选取尺寸大小相近的锦鲫(约20.35 g)进行实验，实验设定3个暴露实验组和1个溶剂(丙酮)对照组。前期96 h急性毒性预实验结果表明，2,3,7,8-TCDT在锦鲫体内的半数致死浓度(LC50，以质量浓度计)大于1.0 mg/L。按照《化学品 生物富集 半静态式鱼类试验》(GB/T 21858—2008)，生物富集暴露实验最高浓度不超过LC50的1%，设置3个暴露实验组的2,3,7,8-TCDT 暴露质量浓度分别为0.1、1.0、10.0 μg/L，每组设3个平行，以体积分数0.01%的丙酮作为助溶剂，对照组中只加等量的丙酮。实验过程中锦鲫无发育异常或死亡现象出现。暴露期间，每天更换一半体积的暴露实验用水并按相应比例重新投毒，使2,3,7,8-TCDT在整个实验周期内保持稳定。第28天取样后更换全部体积的暴露实验用水并停止投毒，转为净化期间，之后每天换一次全部体积的暴露实验用水。每天换水前2 h喂食。每天监测并控制水相的理化条件：pH 7.56±0.06、DO(9.31±0.06) mg/L、温度(20.27±0.12) ℃。分别于第0、1、3、7、14、21、28、30、32、36、42天取一条鱼，立即解剖取出肌肉、鳃和肝脏，用生理盐水洗净后立即液氮冷冻，置于-80 ℃条件下保存；同时取100 mL水样置于0～4 ℃条件下保存。

1.2 锦鲫肝脏氧化损伤实验

以35 L的实验用水作为锦鲫的生存环境，选取大小尺寸相近的锦鲫(约20.35 g)进行实验，实验设置3个暴露实验组和1个溶剂(丙酮)对照组。参照文献[23]，氧化损伤暴露实验最高浓度不超过LC50的10%，设置3个暴露实验组的2,3,7,8-TCDT 暴露质量浓度分别为1.0、10.0、100.0 μg/L，每组设3个平行，以体积分数0.01%的丙酮作为助溶剂，对照组中只加等量的丙酮。暴露实验过程中锦鲫无发育异常或死亡现象出现。第7天暴露结束后取一条鱼立即置于冰块上解剖取出肝脏，用生理盐水洗净后，准确称取0.10 g，加入5 mL生理盐水中制成匀浆液，分别使用A001-1-2型总SOD测试盒、A007-1-1型CAT测试盒、A005-1-2型GPx测试盒和A003-1-2型MDA测试盒测定SOD活力、CAT活力、GPx活力和MDA含量。

1.3 样品处理与分析

使用Labconco FreeZone 4.5型冷冻干燥机将锦鲫的组织样品进行冷冻干燥，研磨过60目筛，准确称取0.10 g，加入5 mL生理盐水中制成匀浆液，置于10 mL离心管中，使用CT14RD型离心机离心3次(转速8 000 r/min)。取上清液加入5 mL正己烷和二氯甲烷的混合液(体积比1∶1，下同)，超声萃取10 min，重复3次，合并萃取液并移入分液漏斗中，加入10 mL浓H2SO4以去除脂肪，再加入20 mL质量分数5%的NaCl溶液，振荡5 min后弃去水相，加入2 g无水Na2SO4干燥，用IKA HB10/RV1型旋转蒸发仪将萃取液浓缩至约1 mL，最后过自填复合硅胶柱净化。

自填复合硅胶柱净化步骤：(1)在有聚四氟乙烯活塞和硅筛板的玻璃色谱柱中自下而上依次填装1 g去活硅胶(含质量分数3%的水)、1 g酸性硅胶(含质量分数40%的H2SO4)、1 g碱性硅胶(含质量分数20%的NaOH)、1 g活化硅胶和1 g无水Na2SO4；(2)用15 mL正己烷清洗自填复合硅胶柱；(3)将浓缩的萃取液加入自填复合硅胶柱中；(4)将50 mL正己烷和二氯甲烷混合液加入自填复合硅胶柱中进行洗脱，收集洗脱液后再用旋转蒸发仪浓缩到约1 mL，用D10-12型氮吹仪吹至近干，用正己烷定容至1 mL，过0.45 μm滤膜后转移至色谱小瓶，封口，待Agilent 7980A/5975C型气质联用仪分析。上机前加入1 ng13C标记的2,2’,3,4,5-五氯二苯基醚(MCDE-86)作为替代标。

水样用固相萃取法(SPE)进行处理，具体方法参照文献[24]，在气质联用仪上机分析前加入1 ng替代标。

气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为99.999%(质量分数)的高纯氦气，流速为1.0 mL/min；进样采用不分流模式，进样口温度为250 ℃，进样体积为1.0 μL；升温程序为先60 ℃保持2 min，再以12 ℃/min升至240 ℃后保持1 min，再以15 ℃/min升至280 ℃后保持4 min。质谱条件：真空度小于10-5Pa，离子源温度为230 ℃，四极杆温度为150 ℃，采用全扫描模式(FS)定性，选择离子模式(SIM)定量。2,3,7,8-TCDT的保留时间为16.62 min，选定的定量离子质荷比为322。

1.4 生物富集动力学参数计算

通过式(1)拟合净化期间的数据得到斜率a，其数值取绝对值即为锦鲫对2,3,7,8-TCDT的净化速率(k2，d-1)，半衰期(t1/2，d)为ln2/k2；通过式(2)拟合暴露期间的数据可得吸收速率，生物富集因子(BCF，L/g)为k1/k2[25]。

lnCT=aT+b

(1)

(2)

式中：CT为净化期间T时锦鲫组织中2,3,7,8-TCDT的质量浓度，μg/g；a、b分别为净化期间数据的回归斜率和常数；Ct为暴露期间t时锦鲫组织中2,3,7,8-TCDT的质量浓度，μg/g；Ct’为水中2,3,7,8-TCDT的质量浓度，μg/L；k1为锦鲫对2,3,7,8-TCDT的吸收速率，L/(d·g)。

1.5 质量控制与质量保证

(1) 确保对照组未检出2,3,7,8-TCDT。(2)2,3,7,8-TCDT的标准曲线相关系数为0.999 2。(3)锦鲫组织中2,3,7,8-TCDT的定量限为0.08～0.14 μg/g。(4)替代标在肌肉、鳃和内脏中的回收率分别为87.25%～102.85%、77.95%～95.37%、75.84%～94.26%。(5)式(1)和式(2)拟合的相关系数均在0.8以上。

1.6 数据处理与统计分析

测得数据均通过正态分布测试和方差齐性检验。使用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s多重比较分析组间的差异性。

2 结果与讨论

2.1 2,3,7,8-TCDT在锦鲫各组织中的生物富集浓度

不同2,3,7,8-TCDT暴露浓度下锦鲫组织中2,3,7,8-TCDT的质量浓度见图1。由于第0天各实验组均未检出2,3,7,8-TCDT，对照组在整个暴露和净化期间也均未检出2,3,7,8-TCDT，因此图1中省略了相应的数据。

图1 锦鲫体内不同组织中的2,3,7,8-TCDT

暴露1 d后，锦鲫所有组织中均检出了2,3,7,8-TCDT，说明2,3,7,8-TCDT可快速被锦鲫吸收并转移。2,3,7,8-TCDT在肝脏中的浓度总体高于鳃中，鳃中又高于肌肉中，说明鳃和肝脏容易富集2,3,7,8-TCDT，特别是肝脏[26]，这是因为肝脏是负责生物代谢的主要组织[27],[28]857。

3个实验组中，锦鲫3种组织中2,3,7,8-TCDT的浓度在暴露期间呈不断增长趋势，到了净化期间开始呈下降趋势。在10.0 μg/L的2,3,7,8-TCDT中暴露28 d时，锦鲫的肌肉、鳃和肝脏中2,3,7,8-TCDT的质量浓度分别达到了12.40、17.65、22.22 μg/g。可以发现，2,3,7,8-TCDT在锦鲫各组织中的生物富集浓度与暴露浓度、暴露时间均正相关。在净化期间，各组织中2,3,7,8-TCDT浓度逐渐下降，说明锦鲫对2,3,7,8-TCDT具有一定的解毒能力，可能是因为2,3,7,8-TCDT被转运或转移到肝脏中代谢而解毒[29]。

2.2 2,3,7,8-TCDT在锦鲫组织中的生物富集动力学参数

锦鲫各组织中2,3,7,8-TCDT的生物富集动力学参数计算结果见表1。

表1 锦鲫各组织中2,3,7,8-TCDT的生物富集动力学参数

2,3,7,8-TCDT在肌肉、鳃和肝脏中的k1分别为0.233～3.204、0.368～6.577、0.412～6.917 L/(d·g)，说明锦鲫从水中生物富集2,3,7,8-TCDT速度最快的组织是肝脏，鳃次之，最后是肌肉，与2,3,7,8-TCDT在锦鲫各组织中的生物富集浓度测定结果吻合。随着2,3,7,8-TCDT暴露浓度的升高，3种组织中的k1均明显降低，说明2,3,7,8-TCDT暴露浓度越低，吸收速率越快。

2,3,7,8-TCDT在肌肉、鳃和肝脏中的k2分别为0.154～0.177、0.176～0.222、0.126～0.181 d-1。2,3,7,8-TCDT在肌肉、鳃和肝脏中的t1/2分别为3.916～4.501、3.112～3.938、3.830～5.501 d。由此说明，净化2,3,7,8-TCDT最快的组织是鳃，而不是肝脏。由于净化期间水中已不含2,3,7,8-TCDT，因此之前的暴露浓度对k2、t1/2的影响不大。

2,3,7,8-TCDT在肌肉、鳃和肝脏中的BCF分别为1.316～20.805、1.658～37.369、2.382～54.897 L/g，可以明显地看出，肝脏的生物富集能力最强，肌肉最弱。随着2,3,7,8-TCDT暴露浓度的升高，BCF逐渐降低，与磺胺类抗生素和羟基化多溴联苯醚在鱼体内的生物富集效应相似[30-31]。产生这种现象的原因可能有：(1)虽然实验过程中锦鲫无发育异常或死亡现象出现，但经2,3,7,8-TCDT诱导后会产生不良反应，对2,3,7,8-TCDT的代谢作用逐渐减弱[32]；(2)锦鲫组织对2,3,7,8-TCDT的吸收能力有限，会随2,3,7,8-TCDT暴露浓度的升高而减弱；(3)2,3,7,8-TCDT具有高疏水性(正辛醇/水分配系数为6.87)，高浓度时易吸附于悬浮颗粒物上或形成胶团[28]859。整体来看，2,3,7,8-TCDT在锦鲫体内具有较强的生物富集效应，其潜在的生态风险不容忽视。

2.3 2,3,7,8-TCDT对锦鲫肝脏氧化损伤的影响

在2,3,7,8-TCDT暴露下锦鲫肝脏中的抗氧化损伤指标见图2。

注：*表示与对照组相比差异显著(p<0.05)，**表示与对照组相比差异极显著(p<0.01)。

与SOD相似，CAT也被认为是抗氧化损伤的第一道防线，它可以分解过氧化氢产生水和氧气[36]。与对照组相比，CAT活力在暴露质量浓度为1.0 μg/L时显著上升，但在2,3,7,8-TCDT暴露质量浓度为10.0、100.0 μg/L时显著降低，分别下降了21.21%、28.95%，这可能与ROS的变化以及SOD作用过程中产生的过氧化氢变化有关。此外，CAT需要还原型辅酶Ⅱ(NADPH)来激发其活力，因此如果缺乏NADPH也可能会降低CAT的活力[37]。

GPx为对抗氧化损伤的第二道防线，在清除自由基和减少过氧化物方面都发挥着重要作用，它可以催化过氧化氢或脂质过氧化氢(LOOH)转化为水[38]236。GPx活力随2,3,7,8-TCDT暴露浓度的变化趋势与SOD活力和CAT活力基本一致。因为肝脏受到低剂量2,3,7,8-TCDT暴露时会同时诱导SOD、CAT和GPx的产生以清除过量的ROS或过氧化物，而随着2,3,7,8-TCDT暴露浓度升高，谷胱甘肽水平降低、ROS和过氧化物增加，GPx活力将受到显著抑制[38]236。

MDA是机体在抗氧化损伤过程中脂质过氧化物的降解产物。MDA随2,3,7,8-TCDT暴露浓度的升高而上升，1.0 μg/L时MDA相对对照组变化不明显，可能是肝脏可以对抗低剂量的2,3,7,8-TCDT暴露引起的氧化损伤，不会出现严重的脂质过氧化，从3种抗氧化酶活力的数据也可证实这一点。但是，在2,3,7,8-TCDT暴露质量浓度为10.0、100.0 μg/L时，MDA相对对照组分别增加了39.61%、63.80%，并且差异极显著。如前所述，随着2,3,7,8-TCDT暴露浓度升高，脂质过氧化产物增加，而抗氧化防御系统不能清除过量的ROS和过氧化物，从而导致细胞氧化损伤，MDA升高。

3 结 论

(1) 2,3,7,8-TCDT在锦鲫体内各组织中的富集能力表现为肝脏>鳃>肌肉。2,3,7,8-TCDT在锦鲫体内各组织中的生物富集浓度与暴露时间、暴露浓度均正相关。在2,3,7,8-TCDT 质量浓度0.1 μg/L的低剂量暴露下也会引起锦鲫体内的生物富集，并且暴露浓度越低，吸收速率越快。

(2) 与对照组相比，锦鲫肝脏中抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)活力在2,3,7,8-TCDT 质量浓度为1.0 μg/L暴露下升高，在10.0、100 μg/L暴露下降低；MDA随2,3,7,8-TCDT暴露浓度升高而上升，特别是在中高剂量下与对照组相比差异极显著(p<0.01)。由此说明，低剂量2,3,7,8-TCDT暴露时会诱导锦鲫肝脏抗氧化酶的产生以清除过量的ROS或过氧化物，而随着2,3,7,8-TCDT暴露浓度升高抗氧化酶受到抑制，锦鲫肝脏会出现氧化损伤。