杨丽娟，付 亮，任星旭，朱 坤，蒋志凯

（河南省新乡市农业科学院/河南省强筋小麦繁育工程技术研究中心，河南 新乡 453000）

黑色小麦和紫色小麦籽粒种皮和糊粉层富含花青素而呈现黑、紫色[1]。花青素是黄酮类水溶性天然色素，对植物具有防止紫外线辐射、防止病害等多种生理功能。食物中的花青素对人类具有抗氧化、保护肝脏、抗癌、预防心脑血管疾病等多种功效[2-3]。黑、紫色小麦中蛋白质以及钙、铁、锌、硒等微量元素含量都显著高于普通小麦[4-5]，是功能型食品和保健型食品的理想原材料。随着生活水平提高，消费者对粮食的需求正在发生深刻的变化，从吃得饱向吃得好、吃得健康转变，美味、营养、美观的有色食品受到了市场青睐。黑、紫色小麦具有高铁、锌、钾、镁、钾钠比、氨基酸、纤维和富硒铬、多色苷等突出特点[6-7]，其推广应用有助于通过传统食物有效预防贫血、糖尿病、心脑血管等病症[8]，在饮食结构改善和特定人群营养状况改良方面将发挥重要作用。

彩色小麦是小麦育种的珍贵种质资源，通过杂交育种或双单倍体育种等现代生物育种技术对彩色小麦种质资源加以利用，选育出高产、优质、抗病且适宜产业化应用的彩色小麦品种是一个大有前景的研究方向。国内黑、紫色小麦品种多采用周黑麦1 号[9]、漯珍1 号[10-11]、中普黑麦1 号[12]等少数骨干亲本选育而成，遗传背景不够明确。目前，关于普通小麦种质资源遗传多样性分析的研究较多[13-17]，而关于彩色小麦种质资源遗传多样性分析的研究尚未见报道。单核苷酸多态性（SNP）标记普遍存在于生物基因组中，在基因组中分布广、密度高，遗传稳定，易于检测而且分型简单[18]。SNP 标记在育种中可应用于遗传多样性检验和基因分型，可以真实反映品种间的亲缘关系[19-20]。为了明确黑、紫色小麦种质间的遗传关系进而从中选择亲本材料，采用15K SNP 芯片数据分析15 份黑、紫色小麦种质资源的遗传差异，并测定籽粒中的花青素含量，为黑、紫色小麦杂交育种亲本选择提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试黑、紫色小麦品种（系）为特色小麦1（紫色，T1）、特色小麦2（紫色，T2）、特色小麦3（黑色，T3）、特色小麦4（黑色，T4）、特色小麦5（黑色，T5）、漯珍1号（黑色，LZ1）、紫色小麦（黑色，ZM）、蜀紫麦1801（紫色，SZ）、卫辉黑小麦（黑色，WHH）、周黑麦1 号（黑色，ZH1）、豫州黑麦1 号（紫色，YZH1）、稷紫黑麦9 号（黑色，JZH9）、永黑麦1 号（黑色，YH1）、豫州黑麦2 号（紫色，YZH2）、同盟黑小麦（黑色，TMH），均由河南省新乡市农业科学院提供。其中，漯珍1 号和周黑麦1 号为商业品种，其他为农艺性状已稳定的品系。供试对照品种为中国春（CS）和新麦26（XM26），均由河南省新乡市农业科学院提供。试验在河南省新乡市农业科学院辉县试验基地进行，所有材料均于2020年10月15日播种，生育期管理同一般大田管理，2021 年6 月2 日人工收获麦穗，各材料用单穗脱粒机脱粒，避免混杂。

1.2 基因组DNA提取与15K芯片分析

2020 年11 月，在田间取新鲜彩色小麦种质叶片，液氮速冻后交由中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司完成基因组DNA提取和中麦芯1号15K SNP 芯片分析。中麦芯1 号是中玉金标记（北京）生物技术股份有限公司运用Affymetrix®Axiom 平台开发的稳定性较高的小麦育种专用芯片，共有13 947个标记，基本均匀覆盖小麦全基因组，每条染色体上2个标记间的物理距离平均为1 M。对DQC（数据质控）＞82%和CR（标记检出率）＞95%的样品进行SNP位点质控，获取9 227个标记，将此批检测数据与公司种质资源库数据合并，进行miss（缺失率）＜10%和maf（最小等位基因频率）＞5%过滤，最终获得7 116 个可用标记，作为有效SNP 位点进行统计分析。将SNP 分型数据分别记为1（纯合AA）、2（杂合AB）、3（纯合BB）和0（缺失），建立原始矩阵。用NTSYS-PC 2.1 软件计算材料间遗传相似度，使用Treebest软件的NJ-tree模型构建进化树[21]。

1.3 籽粒花青素含量测定

以中国春和新麦26为对照，将待测小麦样品籽粒用粉碎机进行粉碎，过孔径250 μm 的筛，称取样品1.00 g 于50 mL 具塞比色管中，加入提取液定容至刻度，摇匀1 min，超声提取30 min，于沸水浴中水解1 h，取出冷却，用提取液再次定容，静置，取上清液，用0.45 μm水相滤膜过滤，4 ℃保存待测，有效期3 d。参考NY/T 2640—2014，采用HPLC 法测定彩色小麦籽粒中飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药素和锦葵色素等6种花青素含量[22]，进一步计算总花青素含量。所用高效液相色谱仪为1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）。色谱柱：Zorbax SB-C18 4.6 mm×250 mm×5μm，美国Agilent 公司）；流动相：A 为1%甲酸水溶液，B为1%甲酸乙腈溶液；检测波长：530 nm；柱温35 ℃，进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 15份黑、紫色小麦种质资源的遗传多样性分析

由表1可知，15份黑、紫色小麦种质资源的SNP标记杂合率均低于3%，纯合度较高，且各种质资源田间长势整齐。

表1 15份黑、紫色小麦种质资源的SNP标记杂合率Tab.1 Heterozygosity rates of 15 germplasm resources with black or purple grain based on SNP markers %

本研究共获得9 227 个SNP 位点，对分型结果进行分析后，获得7 116 个有效SNP 位点（图1），多态性比率为77.12%。每条染色体上的SNP 位点数为128～682 个，在A、B、D 基因组上不均匀分布。B基因组中SNP位点最多，有3 216个，其中，3B染色体上SNP 位点最多，有682 个。D 基因组中SNP 位点最少，有1 544 个，其中，4D 染色体上SNP 位点最少，有128个。

图1 小麦各染色体上的SNP位点分布Fig.1 Distributions of SNP loci on each chromosome in wheat

由表2 可知，15 份小麦种质资源之间的遗传相似度为44.58%～99.94%。遗传相似度最高的2 份种质资源是特色小麦4与漯珍1号，为99.94%；其次是特色小麦3与永黑麦1号（99.43%）、特色小麦1与豫州黑麦1 号（94.65%）；豫州黑麦1 号与特色小麦1、豫州黑麦1号与特色小麦2、特色小麦1与特色小麦2、豫州黑麦2 号与特色小麦2 之间的遗传相似度均高于90%。遗传相似度最低的2份种质资源是豫州黑麦1号与蜀紫麦1801（44.58%）；蜀紫麦1801与多数种质资源间的遗传相似度低于50%，仅与特色小麦3、永黑麦1 号分别达到了50.7%、50.74%；豫州黑麦2 号与特色小麦3、特色小麦5、紫色小麦、周黑麦1 号、永黑麦1 号之间的遗传相似度以及同盟黑小麦与豫州黑麦2 号之间的遗传相似度均低于50%。单份种质资源与其他种质资源间的遗传相似度平均值最高的是特色小麦4（71.50%），最低的是蜀紫麦1801（47.60%）。

表2 15份黑、紫色小麦种质资源的遗传相似度Tab.2 Genetic similarities among 15 germplasm resources with black or purple grain %

根据遗传相似度构建系统进化树（图2），发现蜀紫麦1801 与其他14 份小麦种质资源的遗传距离较远，特色小麦4 与漯珍1 号遗传距离最近。按照遗传距离远近，15份小麦种质资源大致可分为3类；Ⅰ类只包括蜀紫麦1801，与其他小麦种质资源关系较远；Ⅱ类包括永黑麦1 号、特色小麦3、特色小麦5、周黑麦1 号、同盟黑小麦、特色小麦4、漯珍1 号、紫色小麦、稷紫黑麦9 号和卫辉黑小麦等10 份种质资源，其中，漯珍1 号是永黑麦1 号的母本，也是周黑麦1 号的母本；Ⅲ类包括豫州黑麦2 号、特色小麦2、豫州黑麦1号和特色小麦1等4份种质资源，豫州黑麦1 号亲本组合为济麦22/中普黑麦1 号//济麦22，豫州黑麦2 号亲本组合为济麦22/紫优21 号//济麦22。Ⅱ类、Ⅲ类部分种质资源间有明确的系谱关系。部分种质资源来源系谱不明确，根据遗传相似度分析结果，推断其为遗传背景相似品系，例如永黑麦1号与特色小麦3、豫州黑麦1号与特色小麦1、豫州黑麦2号与特色小麦2。

图2 15份黑、紫色小麦种质资源的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of 15 germplasm resources with black or purple grain

2.2 15份黑、紫色小麦种质资源的籽粒花青素含量分析

由表3可知，所有黑、紫色小麦种质资源籽粒的总花青素含量均高于普通小麦中国春和新麦26。大部分黑、紫色小麦种质资源（10份）籽粒中仅含有矢车菊色素、芍药素、锦葵色素3 种花青素；很少一部分黑、紫色小麦种质资源籽粒中除含有矢车菊色素、芍药素、锦葵色素3 种花青素外，还含有少量飞燕草色素、矮牵牛色素、天竺葵色素。大部分黑、紫色小麦种质资源籽粒中矢车菊色素含量均高于芍药素含量。总花青素含量最高的是紫色小麦，其次是周黑麦1 号、卫辉黑小麦，分别为9.83、9.44、8.94 mg/kg，三者之间差异不显著，但显著高于其他种质资源，3 份种质资源均含有5 种花青素，多于其他种质资源含有的花青素种类。在所有种质资源中，卫辉黑小麦籽粒中含有的天竺葵色素和锦葵色素是最高的，周黑麦1 号籽粒中含有的飞燕草色素和矮牵牛色素是最高的，紫色小麦含有的矢车菊色素和芍药素是最高的。在所有黑、紫色小麦种质资源中，蜀紫麦1801 籽粒中总花青素含量最低，为1.23 mg/kg 其次为豫州黑麦2 号、特色小麦2、豫州黑麦1号、特色小麦1、漯珍1 号，籽粒中总花青素含量也较低，在1.50 ～2.23 mg/kg，6 份种质资源间差异不显著。

表3 15份黑、紫色小麦种质资源的籽粒花青素含量Tab.3 Anthocyanin contents in grains of 15 germplasm resources with black or purple grain mg/kg

结合15 份小麦种质资源的系统进化树和花青素含量结果，发现Ⅰ类（蜀紫麦1801）籽粒总花青素含量最低，仅为1.23 mg/kg；Ⅱ类（永黑麦1 号、特色小麦3、特色小麦5、周黑麦1 号、同盟黑小麦、特色小麦4、漯珍1号、紫色小麦、稷紫黑麦9号和卫辉黑小麦）总花青素含量为2.23～9.83 mg/kg；Ⅲ类（豫州黑麦2 号、特色小麦2、豫州黑麦1 号和特色小麦1）总花青素含量为1.50～1.80 mg/kg。可见，3 类种质资源之间总花青素含量有很大差异，总花青素含量表现为Ⅱ类＞Ⅲ类＞Ⅰ类。

3 结论与讨论

目前，利用系谱、农艺性状和分子标记分析评价小麦品种遗传多样性的研究较多[23-28]。本研究选用广泛分布在小麦21条染色体上的9 227个SNP位点对15 份黑、紫色小麦种质资源进行检测，发现SNP 位点多态性比率为77.12%，高于曹廷杰等[28]对河南省96个审定小麦品种的研究结果，说明本研究15 份材料的遗传背景较审定品种宽。亓晓蕾等[16]利用SNP 分子标记进行小麦全基因组扫描，发现不同年份育成的21 个小麦品种中同一年份的品种一般聚在一起，与系谱关系吻合。本研究中聚在同一类的部分小麦种质资源间有明确的系谱关系，永黑麦1 号亲本来源为漯珍1 号/周麦22，周黑麦1 号亲本来源为周麦9 号/漯珍1 号，除了系谱中有共同亲本漯珍1号之外，周麦9号还是周麦22的父本，所以在聚类分析中，永黑麦1 号与周黑麦1 号遗传距离较近，与系谱关系吻合。但二者与共同亲本漯珍1号的遗传距离较远，这可能是参与聚类的种质资源数量和类型有限造成的。

刘易科等[29]研究发现，多态性SNP 位点在小麦B基因组中最多、D基因组中最少。张德强等[30]利用SNP 标记对周8425B 及其16 份衍生品种和23 份黄淮麦区主栽品种进行全基因组扫描，发现不同基因组间多态性SNP 标记的分布表现为B＞A＞D。本研究中SNP 位点在B 基因组中最多、D 基因组中最少，与刘易科等[29]和张德强等[30]结果相似。这主要是因为普通小麦进化过程中D基因组与AABB 基因组形成六倍体小麦时间较短，多态性较低。

紫外可见分光光度法[31]和pH 示差法[32]仅可分析总花青素含量，而HPLC 法可以测定6 种花青素的含量[33]。本研究采用HPLC 法测定的小麦籽粒花青素含量更加准确，类别更加明确。叶琳[34]采用UHPLC-QTOF-MS 测定紫粒小麦科兴617籽粒花青素含量发现，其有11 种花色苷单体，芍药素为第一主要花色苷，矢车菊色素为第二主要花色苷。本研究中12 份小麦种质资源籽粒的第一主要花青素为矢车菊色素，第二主要花青素为芍药素，与科兴617不同，可能是由种质资源差异引起的。李杏普等[35]研究发现，蓝、紫粒小麦籽粒花青素含量是普通小麦的2～6 倍。本研究中15 份黑、紫色小麦种质资源籽粒中总花青素含量最低的蜀紫麦1801 和最高的紫色小麦，其总花青素含量分别是普通小麦新麦26的21 倍和165 倍，这为挖掘、利用高花青素含量的种质资源提供了理论依据。

黑、紫色小麦中存在多个粒色相关的基因[36-37]，本研究中小麦种质资源的SNP 位点丰富，为进一步挖掘粒色相关基因提供了依据。例如：蜀紫麦1801与其他种质资源的遗传差异大，花青素含量较低，可以作为粒色相关位点的研究材料。高明刚等[38]利用SNP 标记进行小麦亲本评价和杂交组合设计，已育成10个审定品种。本研究中，基于SNP标记的聚类分析将15 份小麦种质资源分成3 类，可为杂交组合设计提供参考。赵善仓[39]研究认为，小麦籽粒色素含量由遗传决定，不同小麦品种籽粒中花青素含量差异显著。本研究中不同小麦种质资源间遗传差异大、花青素含量差异大，与赵善仓[39]结论一致。根据聚类分析结果，小麦籽粒中总花青素含量表现为Ⅱ类＞Ⅲ类＞Ⅰ类，3 类之间总花青素含量有很大差异。董亚兵[40]研究认为，贵紫麦1 号基因型和花青素含量呈正相关，与本研究结果一致，这可能是由于控制粒色的基因在系谱相关品种中的遗传和选择引起的。紫色小麦、卫辉黑小麦和周黑麦1 号籽粒中花青素种类丰富而且总花青素含量高于其他种质资源，可与遗传相似度低的其他种质资源进行杂交育种亲本组配。

针对黑、紫色小麦种质资源利用，建议继续广泛收集种质资源，拓宽育种亲本的遗传基础；应用经济高效的花青素含量检测技术，筛选花青素含量高的种质资源；大力加强种质资源的创新研究和利用，利用已有高产优质小麦骨干亲本与搜集到的优异基因资源进行聚合杂交，创造新的优异中间育种材料；借助分子标记辅助选择、双单倍体育种等手段加快育种进度。