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甘草查尔酮A对人脑胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

2022-02-12万珊珊孙晓冬

中国当代医药 2022年3期
关键词:胶质瘤人脑低剂量

万珊珊 孙晓冬 闫 磊

牡丹江医学院组胚教研室,黑龙江牡丹江 157011

脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤,具有发病率高、对放疗和化疗抵抗并容易复发等特点[1-2]。脑胶质瘤是由大脑和脊髓胶质细胞恶变产生的,也是人脑原发性肿瘤中最常见的类型,包括星形细胞瘤,少突胶质细胞瘤和室管膜瘤。根据世界卫生组织标准,胶质瘤分为4 个等级,包括毛细胞型星形细胞瘤(Ⅰ级)、弥散性星形细胞瘤(Ⅱ级)、间变性星形细胞瘤(Ⅲ级)以及多形性胶质母细胞瘤(Ⅳ级)[3]。中药治疗作为新的治疗方法越来越被关注。甘草查尔酮A 是从甘草根中提取出来的黄酮类化合物,具有多种药理学活性,包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗寄生虫及成骨活性、免疫调节、解痉挛等,目前最受关注的是甘草查尔酮A 的抗肿瘤活性[4]。本实验选取人脑胶质瘤U251 细胞为实验对象,探讨甘草查尔酮A对人脑胶质瘤U251 细胞增殖和凋亡的影响。

1 对象与方法

1.1 细胞系

人脑胶质瘤细胞系U251,购自美国ATCC 公司。

1.2 主要仪器与试剂

5417R 台式高速离心机(德国Ep-pendorf 生命科学公司);JYH27020 电泳仪(美国Bio-Rad 公司);ELX800 酶标仪(美国Bio-Tek 仪器公司)。

甘草查尔酮A,纯度>98%,购自成都瑞芬思生物科技有限公司;MTT 试剂购自美国Sigma 公司;胎牛血清购自美国invitrogen 公司。

1.3 实验分组及处理

复苏人脑胶质瘤细胞系U251,将人脑胶质瘤U251细胞分为四组(n=20),对照组予以等量0.9% NaCl 处理,甘草查尔酮A 低剂量组予以15 μmol/L 甘草查尔酮A处理,甘草查尔酮A 中剂量组予以30 μmol/L 甘草查尔酮A 处理,甘草查尔酮A 高剂量组予以45 μmol/L 甘草查尔酮A 处理,干预48 h。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 细胞培养 将人脑胶质瘤U251 细胞培养至含10%胎牛血清、含100 U/L 青链霉素的DMEM 培养基中,置于5% CO2、37℃恒温培养箱中,每隔1~2 d 用胰蛋白酶传代1 次。

1.4.2 细胞增殖实验 将细胞按20 000 个/ml 的密度接种于96 孔培养板上,体积100 μl/孔,每组设3 个复孔。细胞80%融合后,按照分组与给药方法处理细胞,接种48 h 后,取96 孔板行噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium colorimetry method,MTT)检测。每孔加MTT 溶液20 μl,37℃避光培育,4 h 弃孔内上清液,加入150 μl DMSO,振荡10 min,充分溶解结晶后用酶标仪测定在490 nm 处细胞的光密度(optical density,OD)值。

1.4.3 检测各组细胞Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表达水平 以实时荧光定量(real-time fluorescence quantification,PCR)法检测各组细胞Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1mRNA 表达水平。根据GeneBank的β-catenin 和Cyclin D1序列,利用Premier 5.0 软件设计可扩增的产物。引物序列:β-catenin 正向引物5′-CTGCAGGGGTCCTCTGTG-3′,反向引物5′-TGCATATGTCGCCACACC-3′;Cyclin D1正向引物5′-GTCACCTAGCAAGCTGCCGAACC-3′,反向引物5′-CGACAGACAAAGCGTCCCTCAAG-3′;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)正向引物5′-CAACGAATTTGGCTACAG CA-3′,反向引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。

反应体系:cDNA 模板2 μl,正、反向引物(20 μmol/L)各0.8 μl,dH2O 6.4 μl,SYBR Green 10 μl,总体积20 μl。

反应条件:95℃预变性10 min,95℃变性15 s,60℃退火1 min,72℃延伸10 min,共40 个循环,末次循环72℃延伸7 min。重复实验3 次。

目的基因mRNA 的相对表达量用内参GAPDH基因进行均一化,以2-ΔΔCt值表示目的基因的相对表达量。

1.4.4 检测各组目的蛋白表达水平 以蛋白印迹法(Western blot)检测各组的增殖细胞核抗原-67(proliferative nuclear antigen Ki-67,Ki-67)、B 淋 巴细胞瘤-2(B lymphoma-2,Bcl-2)表达水平。收集各组后细胞裂解,离心速率为12 000 r/min,离心半径为10 cm,离心10 min。二喹啉甲酸法进行蛋白定量,行聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离后电转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,孵育30 min,通过凝胶成像分析系统,以GAPDH 为内参对照,计算各个样本目的蛋白条带与GAPDH 条带的灰度比值,作为目的蛋白的相对表达水平。

1.5 统计学方法

采用SPSS for windows 21.0 统计学软件进行数据分析,符合正态分布的计量资料用均数±标准差(±s)表示,多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t 检验;计数资料采用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组人脑胶质瘤U251 细胞培养48 h 后OD 值的比较

MTT 结果显示,甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的OD 值均低于对照组,甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的OD 值均低于甘草查尔酮A 低剂量组,甘草查尔酮A 高剂量组的OD 值低于甘草查尔酮A 中剂量组,差异均有统计学意义(P<0.01)(表1)。

表1 四组人脑胶质瘤U251 细胞培养48 h 后OD 值的比较(±s)

表1 四组人脑胶质瘤U251 细胞培养48 h 后OD 值的比较(±s)

注 与对照组比较,aP<0.01;与甘草查尔酮A 低剂量组比较,bP<0.01;与甘草查尔酮A 中剂量组比较,cP<0.01

组别 例数 OD对照组甘草查尔酮A 低剂量组甘草查尔酮A 中剂量组甘草查尔酮A 高剂量组20 20 20 20 0.83±0.03 0.67±0.05a 0.42±0.04ab 0.30±0.01abc

2.2 四组人脑胶质瘤U251 细胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表达水平的比较

RT-qPCR 结果显示,甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于对照组,甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量均低于甘草查尔酮A 低剂量组,甘草查尔酮A高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于甘草查尔酮A 中剂量组,差异均有统计学意义(P<0.01)(表2)。

表2 四组人脑胶质瘤U251 细胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表达水平的比较(±s)

表2 四组人脑胶质瘤U251 细胞β-catenin、Cyclin D1 mRNA 表达水平的比较(±s)

注 与对照组比较,aP<0.01;与甘草查尔酮A 低剂量组比较,bP<0.01;与甘草查尔酮A 中剂量组比较,cP<0.01

组别 例数 β-catenin mRNA Cyclin D1 mRNA对照组甘草查尔酮A 低剂量组甘草查尔酮A 中剂量组甘草查尔酮A 高剂量组20 20 20 20 0.56±0.03 0.40±0.06a 0.29±0.04ab 0.21±0.01abc 0.86±0.09 0.65±0.10a 0.46±0.08ab 0.39±0.01abc

2.3 四组细胞Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平比较

Western blot 结果显示,甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于对照组,甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于甘草查尔酮A 低剂量组,甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平低于甘草查尔酮A 中剂量组,差异均有统计学意义(P<0.01)(表3)。

表3 四组细胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表达水平比较(±s)

表3 四组细胞Ki-67 和Bcl-2 蛋白表达水平比较(±s)

注 与对照组比较,aP<0.01;与甘草查尔酮A 低剂量组比较,bP<0.01;与甘草查尔酮A 中剂量组比较,cP<0.01

组别 例数 Ki-67 Bcl-2对照组甘草查尔酮A 低剂量组甘草查尔酮A 中剂量组甘草查尔酮A 高剂量组20 20 20 20 0.98±0.02 0.79±0.08a 0.66±0.03ab 0.34±0.01abc 0.64±0.07 0.55±0.02a 0.40±0.03ab 0.29±0.0abc

3 讨论

尽管目前脑胶质瘤治疗技术有了较大进步,患者预后有了较大改善,但脑胶质瘤的治疗仍缺乏突破性进展[5-7]。脑胶质瘤治疗以手术为首选,但由于脑胶质瘤具有浸润生长的特性,与脑组织间无明显边界,难以做到全部切除,必须辅以术后放、化疗杀伤残余肿瘤细胞。胶质瘤的化疗依然存在许多局限性,因此急需革新治疗理念,研发新型药物来有效杀伤胶质瘤细胞,降低复发率及死亡率,提高生活质量以及改善预后等。探索新的治疗药物抑制脑胶质瘤已经成为医学的研究热点,中药治疗将具有非常好的前景。

甘草为我国中医药学中常见的补气类药用植物,其药性平和通行十二经脉,有调和诸药、解毒、补虚、止咳润肺等多种功能,为常用处方药[8]。甘草首载于东汉的《神农本草经》,列为上品,有悠久的药用历史。中医处方离不开甘草,有“十方九草”之说。甘草的主要成分是三萜类化合物和黄酮类化合物[9]。甘草查尔酮A是传统中药甘草的主要成分,其抗肿瘤活性正在成为研究热点[10-12]。

Wnt/β-catenin 信号通路,是一条极其保守的信号转导通路,参与胚胎发育及细胞增殖与分化等正常生理过程,同时,Wnt/β-catenin 通路也是肿瘤进展的关键性通路之一,在很多肿瘤中过渡激活,包括脑、乳腺、结肠、皮肤和肝脏等[13-17]。β-catenin 是Wnt/βcatenin 通路的正性调控因子,生理状态下主要表达在细胞膜上,参与介导同型细胞之间的粘连。Wnt/βcatenin 通路在肿瘤细胞内被激活后促使β-catenin转移,致下游靶基因c-myc、MMP-7 等活化,从而促使肿瘤进展。β-catenin 也是肿瘤干细胞增殖所必需的因素[18]。Wnt/β-catenin 通路的异常激活促进肿瘤的增殖、迁移和侵袭,而阻断Wnt/β-catenin 信号通路除可以抑制肿瘤的迁移、侵袭和血管生成之外,还可能调节肿瘤的化疗敏感性[19-20]。Cyclin D1是Wnt/βcatenin 信号通路的下游原癌基因,它控制着细胞周期从G1 期向S 期的转变,主要促进细胞增殖。本研究结果显示,甘草查尔酮A 低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于对照组,甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量均低于甘草查尔酮A 低剂量组,甘草查尔酮A 高剂量组的β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA 相对表达量低于甘草查尔酮A中剂量组,差异均有统计学意义(P<0.01),这表明了甘草查尔酮A 可能通过Wnt/β-catenin 信号通路抑制人脑胶质瘤U251 细胞增殖。

增殖细胞核抗原Ki-67 是细胞作为细胞周期中核抗原的决定簇,在细胞周期中所有处于活动期的细胞均可表达,在肿瘤细胞中广泛应用作为处于增殖状态的标志物。Bcl-2 能够抑制细胞凋亡,延长细胞寿命,属于抗凋亡基因[20]。本研究结果显示,甘草查尔酮A低剂量组、甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于对照组,甘草查尔酮A 中剂量组和甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平均低于甘草查尔酮A低剂量组,甘草查尔酮A 高剂量组的Ki-67、Bcl-2 蛋白表达水平低于甘草查尔酮A 中剂量组,差异均有统计学意义(P<0.01),这表明了甘草查尔酮A 可能通过Ki-67 和Bcl-2 蛋白抑制人脑胶质瘤U251 细胞增殖和促进凋亡。

综上所述,甘草查尔酮A 对人脑胶质瘤U251 细胞有抑制增殖和促进凋亡作用,其机制可能与下调β-catenin mRNA、Cyclin D1mRNA、Ki-67 和Bcl-2 表达水平有关。肿瘤增殖是肿瘤患者致死的最直接原因,本实验提示中药治疗脑胶质瘤可能发挥较好作用,这为脑胶质瘤的治疗提供了一个新的方向。

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