李红艳，余先锋，盛 灿，李瑜霞

0 引 言

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种致残、不可逆转的神经退行性疾病，严重影响患者的生活质量，加重社会和家庭的负担[1-2]。糖尿病是AD危险因素，可能通过直接影响大脑中的β淀粉样蛋白(Amyloid beta protein，Aβ)沉积来增加AD的患病风险[3-5]。因此探讨糖尿病与AD之间的关系，有利于在危险因素层面防治AD。

目前关于AD的早期生物标记物众多，如多模态磁共振成像、18F-florbetapir(AV45)正电子发射断层成像(positron emission tomography, PET)[6]；然而尿阿尔茨海默相关神经丝蛋白(urinary Alzheimer-associated neuronal thread protein，AD7c-NTP)由于其无创、无辐射、可重复测量、操作简单、易于广泛开展等特点，已经成为一种具有良好应用前景的AD外周生物标记物。AD和轻度认知障碍患者尿AD7c-NTP升高[7]；然而，目前对于其作为老年糖尿病患者认知障碍生物标志物的可行性尚未明确。本研究通过对比糖尿病伴有认知功能下降组(diabetes mellitus with cognitive decline group，DMCD)与认知功能正常组(normal control，NC)患者尿AD7c-NTP水平，探讨尿AD7c-NTP升高与认知域下降的相关性，进一步明确尿AD7c-NTP在伴有认知功能下降的老年糖尿病患者中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2017年3月至2021年12月就诊于首都医科大学宣武医院神经内科门诊及记忆专科门诊的110例糖尿病伴有认知功能下降患者(DMCD组)。其中2型糖尿病的诊断基于美国糖尿病协会制定的诊断标准：有糖尿病病史的患者，且空腹血糖升高(≥7.0 mmol/L或>126 mg/dL)[8]。排除标准：患有严重肝肾功能障碍、心功能衰竭，既往脑卒中病史，癫痫或痫性发作，严重的精神疾病，如精神分裂症或严重抑郁，头部外伤伴意识丧失病史者，酗酒或药物滥用，帕金森病等。同期收集老年糖尿病认知功能正常者135例(NC组)，既往无认知障碍，无神经、精神系统相关疾病病史。所有入组受试者均为右利手，汉族，并签署知情同意书。临床试验注册号为：ClinicalTrials.gov NCT03370744，临床试验注册机构为首都医科大学宣武医院。本研究已经通过首都医科大学宣武医院伦理委员会批准(批件号：临研审[2017]046号)。

1.2研究方法所有受试者进行临床资料的采集，全面的体格检查及神经心理测评包括简易智能精神状态量表(mini-mental state examination，MMSE)、蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment，MoCA)、Rey听觉词语学习测验(Auditory Verbal Learning Test，AVLT)、动物词语流畅性(Animal Verbal Fluency Test，AVFT)、波士顿命名测验(Boston Naming Test，BNT)、连线测验A(Shape trails tests-A，STT-A)、连线测验B(Shape trails tests-B，STT-B)等。

依据受教育程度及MoCA判定受试存在认知功能减退：MoCA分数在受教育年限0～6年的受试者MoCA<19分；受教育年限7～12年的受试者MoCA<22分；受教育年限≥13年受试者MoCA<24分[9]。

1.3尿AD7c-NTP的检测所有受试者采集清晨清洁中段尿液样本。按照参考文献[10]进行离心后放入4°C冰箱中保存。采用酶联免疫吸附试验AD7c-NTP试剂盒(中国深圳安群生物科技有限公司)测定尿AD7c-NTP水平[10]。将100μL待测样品加入相应的孔中，设空白对照，在37 ℃下孵育1 h。用磷酸盐缓冲盐(phosphate-buffered saline，PBS)洗涤5次。拍干后加入生物素化的兔抗AD7c-NTP抗体，孵育30 min，PBS洗涤5次。将样品中加入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白，孵育30min，PBS洗涤5次。依次加入50 μL显色剂A和B，孵育15 min，PBS洗涤5次，拍干。最后，通过添加50μL硫酸作为停止缓冲液。使用450 nm波长的微孔板阅读器(Multiskan Spectrum，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)测量每个样品的光密度值。根据重组人AD7c-NTP肽的标准曲线，计算尿AD7c-NTP水平。

2 结 果

2.1 受试人口学资料和神经心理学测评结果分析DMCD组和NC组患者性别、年龄、受教育程度差异均无统计学意义；而MMSE、MoCA、AVLT的长延迟回忆(AVLT-N5)及BNT的得分差异有统计学意义(P< 0.05)。DMCD组患者AVLT-N7、STT-A、STT-B及AVFT与NC组相比，差异无统计学意义(P> 0.05)。

2.2受试血糖和尿AD7c-NTP水平对比两组受试血糖比较差异有统计学意义(P<0.05)；DMCD组尿AD7c-NTP水平显著高于NC组。见表1。

2.3尿AD7c-NTP水平与认知功能损害指标的相关性分析两组受试尿AD7c-NTP水平与MoCA评分(r=-0.175)和波士顿命名评分(r=-0.172)呈负相关，但与AVLT-N5、AVLT-N7以及STT-A、STT-B、AVFT评分无关(P>0.05)。见表2，图1。

表 1 所有受试者的人口学和临床特征对比分析

表 2 尿AD7c-NTP水平与认知功能损害指标相关性

a:MoCA评分; b:波士顿命名评分

3 讨 论

3.1认知功能下降的老年糖尿病患者尿AD7c-NTP水平升高AD7c-NTP在转染的神经元细胞中过表达促进神经元炎症和细胞死亡，这两个重要的神经解剖学损伤与AD痴呆相关[11]。既往研究表明，AD7c-NTP免疫反应性与神经原纤维缠结和营养不良神经突共定位，AD7c-NTP异常水平与tau免疫反应性神经原纤维缠结有关[7]。本研究发现在认知功能下降的老年糖尿病患者尿AD7c-NTP水平升高，与NC组比较存在显著差异，这与本课题组既往的研究一致[12]。同时研究发现，认知功能下降患者血糖水平显著高于对照组患者，这也间接验证了血糖影响认知功能，血糖高者加重认知功能损伤。本课题组既往研究表明，在一般人群中，尿AD7c-NTP水平与糖化血红蛋白(r=0.104)、胰岛素(r=0.101)、三酰甘油(r=0.093)呈正相关[12]。对于存在AD危险因素(糖尿病、高三酰甘油血症)受试者，尿AD7c-NTP水平略有升高，但未达到诊断认知功能障碍的临界值。尿AD7c-NTP可作为预测AD风险的潜在的外周生物标记物[12]。

研究显示，AD是一种与胰岛素信号相关的神经内分泌疾病，被称为是“第三类糖尿病”[13]。由于AD与胰岛素信号通路受损有许多共同的特点，因此AD可被视为一种代谢性疾病。在某些情况下，如代谢异常，身体的糖尿病状态可以通过影响葡萄糖向大脑的转运和降低葡萄糖代谢来增加AD的发病率[13]。此外，由于糖尿病患者丰富的脂肪含量和高能量需求，大脑的代谢对线粒体提出了很大的要求。因此，大脑可能比身体其他部位更容易受到氧化损伤。最新证据表明，氧化应激和线粒体功能障碍都与Aβ病理学有关。未折叠蛋白反应或内质网应激中的蛋白变化可调节Aβ的产生，与tau蛋白的病理变化密切相关。总之，糖尿病引起的代谢紊乱包括糖/脂代谢、氧化应激、线粒体功能障碍和蛋白质变化与胰岛素信号通路受损有关，这些代谢因子可能通过促进Aβ病理改变而增加糖尿病患者AD的患病率[3]。目前研究表明，2型糖尿病和高胰岛素血症可能通过对Aβ代谢和脑血管功能障碍的影响增加AD的风险[14]。即使是在糖尿病前期，空腹和餐后2h血糖水平与认知功能之间也存在线性关系[15]。研究表明，神经丝蛋白(neuronal thread protein,NTP)的表达受胰岛素和胰岛素样生长因子1刺激的转录水平调节[16]。研究表明，高血压伴认知下降组尿AD7c-NTP水平显著高于NC组，尿AD7c-NTP水平与MoCA评分和胰岛素抵抗指数相关[17]。这些结果都与本研究结果一致。因此，重视危险因素的筛查和干预可作为AD的一级预防策略[18]。

3.2尿AD7cNTP水平与MoCA和波士顿命名评分呈负相关本研究显示，尿AD7c-NTP的升高，与认知损害相关，认知损害越重，MoCA评分越低，尿AD7c-NTP水平越高。既往研究显示，尿AD7c-NTP已经被证实在AD痴呆期以及AD痴呆前的MCI期升高[7, 10]。尿AD7c-NTP的升高与认知功能下降有关；且尿AD7c-NTP水平与认知功能成负相关[19-20]。既往研究表明，尿AD7c-NTP在主观认知下降阶段未升高，其升高可能与更加严重的认知功能损害相关[20]。在认知正常人群中，尿AD7c-NTP水平与ApoE等级呈正相关，尿AD7c-NTP水平在存在AD风险因素的受试者中升高[21]。本研究进一步证实了这一观点，尿AD7c-NTP的升高仍然是与认知功能的下降相关，认知功能下降的老年糖尿病患者应积极做好预防，警惕进一步认知功能的恶化。

本研究还发现，波士顿命名的下降与尿AD7c-NTP水平呈负相关。波士顿命名是反映语言表达能力、命名能力的量表[22]。这提示老年糖尿病患者的认知功能损害是在语言表达和命名这一认知域分数越低，语言表达能力损害越大，尿AD7c-NTP水平越高，这一结果仍需大样本进一步验证。

本研究存在着不足与局限性。首先样本量小，结果可能产生偏移；再者，本研究未能采集所有受试者的胰岛素水平，由于数据不全，未进一步分析受试者的胰岛素抵抗指数，今后我们将继续完善相关数据资料，扩大样本量，对患者进行动态随访观察。

综上所述，本研究提示认知功能下降的老年糖尿病患者尿AD7c-NTP水平升高，波士顿命名评分降低与尿AD7c-NTP水平呈负相关。