王新玲,李书杰,林红,裴明财,朱靖,韩兆玉

(1.南京农业大学动物科技学院乳牛科学研究所,江苏 南京 210095)

反刍动物的瘤胃中栖息着繁杂多样的细菌、原虫和厌氧真菌等,它们被统称为瘤胃微生物。反刍动物自身与瘤胃微生物之间存在着极其复杂的相互作用。一方面,宿主遗传信息决定瘤胃微生物结构并为其提供生存和繁衍的环境条件;而另一方面,瘤胃微生物又可以消化机体摄入的一些物质,保证反刍动物个体获取所需的营养[1]。宿主的健康和胃肠道内环境稳态的维持很大一部分原因得益于瘤胃微生物群落的稳定性,也就意味着微生物群的紊乱会导致瘤胃代谢异常进而诱发胃肠道疾病,如瘤胃酸中毒和肠道炎症[2-3]。以往的研究表明,瘤胃中的某些微生物(如Prevotella和Ruminococcus等)与反刍动物饲料的利用率有着很强的相关性[4-5]。饲料利用率的提高不但减少了动物生产对环境的负面影响,而且大大提高了经济效益。因此,维持瘤胃微生物菌群稳态是保障反刍动物宿主健康和高效生产的关键。

凹凸棒石是一种具有棒晶形貌及孔道结构的镁铝硅酸盐矿物。凹凸棒石由于其优异的吸附能力被作为一种饲料添加物,其可吸附肠道致病菌、霉菌毒素等有毒有害物质,对动物机体的腹泻以及胃肠疾病的防治起到关键作用[6-8]。在养殖业抗生素滥用导致耐药病原菌增多、肠道微生物多样性降低、动物免疫机能下降和药物残留等一系列安全问题的背景下,凹凸棒石可作为一种安全、便捷的饲料抗生素替代品。2013年,凹凸棒石已被我国农业农村部纳入饲料原料[9]。已有研究者对凹凸棒石进行了大量改性研究,以进一步优化其抗菌性能,便于更好地应用于动物生产中[10]。常见改性方式有酸改性、热改性和有机化改性等[10]。作为功能性饲料添加剂,凹凸棒石被广泛应用于猪、鸡等单胃动物饲料生产中。Zhang等[11]报道,日粮添加凹凸棒石(2 000 mg·kg-1)可以增加断奶仔猪的肠道绒毛高度,提高肠道完整性和屏障功能。Chen等[12]发现在日粮中添加凹凸棒石能够改善肉鸡早期肠道免疫功能和增强抗氧化机能。我们先前的体外研究结果显示,热改性的凹凸棒石和载锌凹凸棒石可以改善瘤胃微生物的发酵,提高细菌多样性,促进挥发性脂肪酸(VFA)的形成和氮的利用[13-14]。然而,凹凸棒石在反刍动物生产中的研究还鲜有报道。

本试验利用在凹凸棒石棒状形貌表面担载具有较强抗菌活性的ZnO和季铵化改性的壳寡糖,进而制备得到一种安全、高效、广谱和生物相容性好的壳寡糖/ZnO/凹凸棒石纳米复合剂(又称改性坡缕石modified palygorskite,MPal)[15]。先前研究结果已经表明,饲粮中添加该复合剂有提高湖羊生长性能和屠宰性能的趋势,并且能够改善肉品质[16]。在本试验中,以湖羊作为研究对象,在日粮中添加此复合剂(500 mg·kg-1),再结合16S高通量测序和代谢组学,分析研究壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂对湖羊瘤胃微生物菌群组成和代谢产物的影响,旨在为养殖业提供高效、安全的饲料添加剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂从江苏神力特生物科技股份有限公司获得,是以天然凹凸棒石为原料,采用“表面改性—电荷—抗菌因子—组装—表面交联”的综合工艺制备而成。该复合剂的主要成分:凹凸棒石73%、氧化锌10%、月桂酸甘油酯8%、壳寡糖9%。

1.2 动物饲养与试验设计

试验于江苏省宿迁康喜肉羊养殖公司开展,选取48只60～70日龄的健康湖羊[(15±5)kg],随机分为2组,每组24只,公母各半,6个重复,每个重复4只。羊饲养在独立的围栏内,每天08:00和18:00喂养2次,自由饮水。其中对照组(Con)饲喂全混合配方颗粒料,复合剂组(MPal)于日粮中添加复合剂(500 mg·kg-1),预饲期7 d,正式试验期80 d。每个重复随机选取1只试验湖羊,即最终对照组与复合剂组各随机选取6只湖羊(公母各半)屠宰采样。湖羊饲喂日粮的具体成分见表1。

表1 湖羊全混合日粮配方及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diet(dry matter basis)

1.3 样品采集与制备

湖羊屠宰后,采集瘤胃液,用4层纱布过滤后于-80 ℃保存,用于后续微生物测序和代谢组学分析。

1.4 瘤胃液总菌DNA提取及Illumina MiSeq 16S rDNA微生物测序

利用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit(D4015,Omega,USA)按照说明书进行提取瘤胃液中基因组总DNA。

为了进行细菌多样性分析,以瘤胃液DNA样本为模板,通过应用引物对343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)/798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)扩增16SrRNA基因V3—V4区域。用凝胶电泳观察扩增子的质量,经纯化后进行另一轮PCR扩增,然后进行定量分析。后续高通量测序工作由上海欧易生物科技有限公司完成。

使用Trimmomatic软件对原始双端序列去杂,并采用滑窗法检查平均碱基质量,当质量低于20时,截取前面高质序列。去杂后的双端序列利用FLASH软件进行拼接。拼接参数:overlap最小为10 bp、最大为200 bp、最大错配率为20%。为保证结果的准确性,可进行精准去杂,去除含有模糊碱基(ambiguous)、单碱基高重复区(homologous)的序列以及长度过短的序列。精准去杂参数:去掉含有模糊碱基的序列,保留碱基质量分数(Q20)≥75%的序列。同时利用UCHIME检测并去除序列中的嵌合体序列。测序数据进行预处理生成优质序列之后,采用Vsearch软件分析序列的相似度,序列相似度大于或等于97%被归为一个OTU单元(主操作分类单元)。使用QIIME软件包挑选出各个OTU的代表序列,并将所有代表序列与数据库进行比对注释。通过数据平台网站(https://www.microbiomeanalyst.ca/)对微生物数据进行后续分析。

1.5 瘤胃液代谢组学分析

将10 μL溶于甲醇中的2-氯-L-苯丙氨酸(0.3 mg·mL-1)作为内标物和80 μL样品共同加入1.5 mL离心管中,然后在冷冻干燥器中干燥。向每个样品中加入240 μL甲醇/乙腈混合物,冰水浴超声波处理 5 min,然后4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min。取上清液转移到玻璃取样瓶中,室温真空干燥。在吡啶中添加80 μL 15 mg·mL-1甲氧基胺盐酸盐后涡旋2 min,37 ℃培养1.5 h。

瘤胃液的代谢物由上海鹿明生物技术有限公司采用GC/MS方法鉴定。样品在安捷伦7890B气相色谱系统和安捷伦5977A MSD系统(Agilent Technologies Inc.,USA)上进行分析。采用DB-5MS熔融石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm,Agilent J & W Scientific,USA)分离衍生物。氦气(>99.999%)作为载气,以1 mL·min-1的恒定流速通过色谱柱。注射器温度260 ℃,柱温箱最终温度305 ℃。质谱条件:电子轰击离子源(EI),离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,电子能量70 eV。扫描方式为全扫描模式(SCAN),质量(m/z)扫描范围50～500。

1.6 数据统计分析

微生物数据通过SPSS 20.0软件进行分析,使用独立样本t检验分析瘤胃液菌群多样性指数,使用非参数Kruskal-Wallis检验微生物门、属水平相对丰度的变化。利用PICRUSt软件预测微生物的功能,通过iPath 3.0(https://pathways.embl.de)对预测的 KEGG orthology groups(KO)进行汇总分析,并将预测的功能可视化地呈现于代谢通路中。代谢组学数据经MetaboAnalyst 在线网站(https://www.metaboanalyst.ca/)进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和差异代谢物筛选,以错误发现率(FDR)<0.05 和变量权重重要性排序(VIP)>1为筛选标准。Pearson相关性分析使用 Graphpad Prism 7.00(Graphpad Software,USA),分析0.05水平的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂对湖羊瘤胃菌群丰富度和多样性的影响

如图1-A所示,与对照组(Con)湖羊相比,复合剂组(MPal)湖羊的丰富度指数Chao1、Ace和多样性指数Shannon均显著升高(P<0.05)。此外,主坐标分析(PCoA)结果也显示,对照组与复合剂组微生物菌群明显分开(P<0.05)(图1-B)。

图1 复合剂对湖羊瘤胃细菌多样性的影响(A)及主坐标分析(B)Fig.1 Effects of MPal supplementation on the diversity of ruminal bacterial communities(A) and principle-coordinate analysis(B)Con:对照组 Control group;MPal:壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂组Modified palygorskite group. *P<0.05. 下同The same as follows.

2.2 壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂对湖羊瘤胃微生物门、属水平相对丰度的影响

如图2所示,在门水平上,拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)和软壁菌门(Tenericutes)是瘤胃微生物的优势菌门,复合剂饲喂后,瘤胃中厚壁菌门和纤维杆菌门的相对丰度显著升高(P<0.05),拟杆菌门丰度有下调趋势(P=0.065),而其他优势菌门均没有发生变化。

图2 MPal对湖羊瘤胃微生物门水平上的组成(A)和差异(B)影响Fig.2 Effects of MPal supplementation on the composition(A)and difference(B) of the bacterial phylum level in rumen of Hu sheep

在细菌聚类属水平上,我们重点分析了丰度在前30的细菌属(图3)。其中,与对照组相比,复合剂组理研菌科RC9菌属(Rikenellaceae RC9 gut group)、Ambiguoustaxa、纤维杆菌属(Fibrobacter)、瘤胃球菌科UCG-002(Ruminococcaceae UCG-002)和瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)的相对丰度显著升高(P<0.05);而普雷沃氏菌属1(Prevotella1)、新月形单胞菌属1(Selenomonas1)、普雷沃氏菌科YAB2003菌属(Prevotellaceae YAB 2003 group)和Eubacteriumruminantiumgroup的相对丰度显著降低(P<0.05)。

图3 MPal对湖羊瘤胃相对丰度Top30细菌属水平的影响Fig.3 Effects of MPal supplementation on ruminal microbial community of the genus level(Top30)

2.3 湖羊瘤胃微生物PICRUSt功能预测

通过PICRUSt预测瘤胃菌群代谢功能,并利用iPath数据库将分析的结果进行整合(图4)。结果显示,与对照组相比,复合剂提高了细胞运动、信号传导、转运催化和分泌系统等相关途径的丰度,同时降低了核酸代谢和感染性疾病等相关途径的丰度(P<0.05)。

图4 湖羊瘤胃微生物基因富集KEGG通路PICRUSt功能预测Fig.4 The KEGG enrichment analysis on PICRUSt-predicted metabolic pathways of ruminal microbiota in Hu sheep

2.4 壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂对湖羊瘤胃代谢产物的影响

我们进一步通过代谢组学分析试验组与对照组瘤胃液代谢产物的差异。结果显示:瘤胃液中共检测出288种代谢物,主要分为氨基酸类、有机酸类、脂肪酸类、胺类、脂类、糖类等。如图5所示,偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)结果显示:2组间代谢产物可以被显著区分开,说明2组间代谢产物存在差异。通过统计分析及PLS-DA获得VIP值,以FDR<0.05和VIP>1为筛选标准,共筛选出73种差异代谢产物。表2所示为排名前30的差异代谢物,主要是脂肪酸类、有机酸类、糖类、固醇类等。与对照组湖羊相比,复合剂组湖羊瘤胃中丙酸、磷酸葡萄糖酸、白藜芦醇和丁香酸等含量显著升高,而与脂质代谢有关的亚油酸、花生四烯酸、胆固醇、胆汁酸、棕榈酸、2-单硬脂酸酯、1-单十七烷基甘油酯等含量显著降低(FDR<0.05)。这表明饲喂复合剂对瘤胃脂质代谢具有重要的调节作用。

图5 湖羊瘤胃代谢物的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)Fig.5 Partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) of ruminal metabolites of Hu sheep

表2 湖羊瘤胃差异代谢物Top30Table 2 List of ruminal fluid metabolites that showed Top30 significant difference between Con and MPal groups

2.5 瘤胃液差异微生物菌属与差异代谢物相关性分析

对瘤胃变化的微生物菌属与差异代谢产物进行了皮尔森相关性分析(图6)。结果显示,纤维杆菌属(Fibrobacter)、理研菌科RC9菌属(Rikenellaceae RC9 gut group)和瘤胃球菌科UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)与瘤胃丙酸含量均呈现显著正相关(P<0.05)。亚油酸、花生四烯酸、胆固醇等代谢物与普雷沃氏菌属1(Prevotella1)呈显著正相关,而其与瘤胃球菌科 UCG-014(Ruminococcaceae UCG-014)呈显著负相关(P<0.05)。

图6 湖羊瘤胃差异菌属与差异代谢物相关性分析Fig.6 Pearson correlation analysis of significantly changed bacterial genera and metabolites in rumen 红色、绿色和白色分别代表显著正相关(P<0.05)、显著负相关(P<0.05)和不相关(P>0.05)。The red,green and white color represent significant positive correlation(P<0.05),significant negative correlation(P<0.05),and no correlation(P>0.05),respectively.

3 讨论

3.1 壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂对湖羊瘤胃微生物区系的影响

瘤胃微生物中的细菌种类繁多,各种细菌协同作用将饲料降解转化为短链脂肪酸等代谢产物,为宿主提供充足的能量和养分。肠道菌群的多样性是保障其完善功能的前提。肠道菌群多样性与宿主对病原微生物的抵御能力成正相关[17]。在本试验中,2组微生物菌群显著不同,这表明饲喂复合剂改变了湖羊瘤胃微生物菌群结构。与对照组相比,复合剂组瘤胃微生物的丰富度指数(Chao1、Ace)和多样性指数(Shannon)均显著升高。这表明饲喂复合剂增加了湖羊瘤胃微生物多样性。湖羊瘤胃微生物主要以拟杆菌门和厚壁菌门为主[18]。本试验结果显示,湖羊瘤胃中相对丰度大于1%的菌门主要有拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、纤维杆菌门和软壁菌门。与对照组相比,复合剂组瘤胃中厚壁菌门和纤维杆菌门的相对丰度显著升高,拟杆菌门相对丰度有下调趋势。厚壁菌门和纤维杆菌门的主要作用为分解纤维类物质,对植物性纤维转化为挥发性脂肪酸(乙酸、丙酸等)发挥重要作用[19-20]。而拟杆菌门主要参与瘤胃中的蛋白质和非纤维植物多糖的降解[21]。

在本试验中,普雷沃氏菌属1是瘤胃液中丰度最高的属,与先前的研究相一致[22]。分析Top30的属水平相对丰度发现,与对照组相比,复合剂组瘤胃中理研菌科RC9菌属、纤维杆菌属、瘤胃球菌科UCG-002和瘤胃球菌科UCG-014的相对丰度显著升高;而普雷沃氏菌属1、新月形单胞菌属1和普雷沃氏菌科YAB2003菌属的相对丰度显著降低。理研菌科RC9菌属能够促进纤维素的降解,其丰度与日粮纤维含量呈正相关[23]。瘤胃球菌科UCG-002和瘤胃球菌科UCG-014都属于瘤胃球菌科。已有研究指出,瘤胃菌科与瘤胃中纤维素类物质的降解密切联系,当饲喂高纤维饲粮时其丰度会大大提高[24-25]。同样,纤维杆菌属也是一种重要的纤维降解菌。普雷沃氏菌属1能够参与饲粮蛋白质的降解,其相对丰度与饲粮蛋白质水平相关[26]。这些结果表明,壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂增加了湖羊瘤胃中纤维降解菌的丰度,而降低了蛋白降解菌的丰度。

3.2 壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂对湖羊瘤胃代谢组学的影响

胃肠道微生物结构与其代谢产物直接关联。本试验中,我们通过代谢组学分析了复合剂对湖羊瘤胃内容物代谢组学的影响。主成分分析结果显示,对照组与复合剂组的代谢物组成明显区分开,表明复合剂显著改变了瘤胃代谢产物组成。差异代谢物结果显示,与对照组相比,复合剂组湖羊瘤胃中丙酸和磷酸葡萄糖酸含量显著升高。瘤胃微生物通过将宿主自身不能消化的植物性饲料降解,产生大量的VFA为宿主提供养分。成年反刍动物大约70%的能量来源于VFA提供,而相较于乙酸和丁酸,瘤胃丙酸发酵对机体的供能效率最高[27]。因此,促进瘤胃中丙酸的发酵有助于提高反刍动物的饲料转化利用率。Zeng等[14]通过体外发酵试验发现,热改性凹凸棒石处理能够促进瘤胃中乙酸和丙酸的产生。张心壮等[28]研究发现,饲粮添加丙酸盐能够促进犊牛瘤胃发酵,提高瘤胃内丙酸的含量,并且能够促进瘤胃上皮细胞发育和提高犊牛生长性能。对瘤胃差异菌属和差异代谢物进行相关性分析发现,纤维杆菌属、理研菌科RC9菌属和瘤胃球菌科UCG-014与瘤胃丙酸含量均呈现显著正相关。这些结果表明,饲喂复合剂改变了瘤胃微生物组成,从而促进了纤维类物质的分解和丙酸的生成。

此外,饲喂复合剂显著降低了湖羊瘤胃中与脂质代谢相关的代谢物含量,包括亚油酸、花生四烯酸、胆固醇、胆汁酸、棕榈酸、2-单硬脂酸酯、1-单十七烷基甘油酯等。高浓度的多不饱和脂肪酸具有毒性,其与瘤胃微生物的细胞壁形成复合物从而抑制瘤胃微生物的生长[29]。瘤胃微生物能够通过氢化作用将不饱和脂肪酸降解脱毒,瘤胃球菌科和纤维杆菌属等细菌与氢化产物存在关联[25,30-31]。Hu等[32]研究发现肠道中普氏菌属的含量与甘油三酯和总胆固醇的含量成正相关。相关性分析发现,亚油酸、花生四烯酸、胆固醇等代谢物与普雷沃氏菌属1显著正相关,而其与瘤胃球菌科UCG-014显著负相关。因此,日粮添加复合剂影响了湖羊瘤胃脂质代谢,但其具体调节机制还有待进一步研究。

综上,日粮中添加壳寡糖/ZnO/凹凸棒石复合剂能够提高瘤胃菌群丰富度和多样性水平,有利于湖羊的胃肠道健康,同时对瘤胃菌群丰度具有调节作用。复合剂促进了瘤胃中丙酸的生成,并降低了瘤胃中多种不饱和脂肪酸的含量,对湖羊瘤胃脂质代谢起到重要的调节作用。湖羊瘤胃差异微生物与差异代谢产物具有较强的正/负相关关系。