章小霞，任晓燕，陶玉梅，袁明明，顾丽丽，王燕

1南通市妇幼保健院病理科，江苏南通226006；2南通大学附属医院病理科

子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤，近年来，我国子宫内膜癌的发病率呈逐年上升趋势，并逐渐年轻化。目前治疗子宫内膜癌的主要方法是手术切除辅以放疗和药物治疗，但大多数患者术后生存时间短，生活质量较差，且极易出现耐药性。靶向治疗的迅速发展为子宫内膜癌提供了新的治疗手段，但多数靶向药物仍处于实验阶段，寻找具有针对性的分子标志物是攻克子宫内膜癌的关键。Geminin基因(GMNN)是一种小分子蛋白，在多种恶性肿瘤中呈高表达，是细胞周期调控的关键因子[1]。RFC4是复制因子C(RFC)复合体的几个亚基之一，作为聚合酶辅助蛋白在DNA复制和修复中起作用，RFC4失调可促进细胞增殖和肿瘤发生[2]。关于子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4的表达情况及其与患者预后关系的研究目前罕见报道。本研究利用数据库进行生物信息学分析，观察子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4 mRNA的表达变化，探讨其与患者临床病理参数及预后的关系，并利用临床标本对分析结果进行验证，旨在为子宫内膜癌的诊断与预后评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物信息学网上数据库 UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，OncoLnc数据库(http://www.oncolnc.org/)，基因表达谱数据动态分析(GEPIA)数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)。

1.1.2 组织标本来源 收集2020年在南通大学附属医院行手术切除的40例子宫内膜癌患者的新鲜癌组织及癌旁组织(距离肿瘤直径2 cm)，患者年龄≤55岁67例，>55岁66例；肿瘤组织分级G1级32例，G2级73例，G3级28例；肿瘤浸润深度<1/2肌层110例，≥1/2肌层23例；FIGO病理分期Ⅰ+Ⅱ期88例，Ⅲ+Ⅳ期45例；合并淋巴结转移35例；绝经100例；ER阳性61例，PR阳性68例，Her-2 0～2+ 109例、3+ 24例，Ki67阳性65例，p53阳性38例。另收集2013年1月1日—2016年6月30日南通大学附属医院病理科保存的石蜡标本，包括120例正常子宫内膜组织、100例不典型增生子宫内膜组织及133例子宫内膜癌组织。所有患者手术前未接受过抗癌治疗，临床资料及术后随访记录完整。

1.2 方法

1.2.1 子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4 mRNA和蛋白表达检测

1.2.1.1 子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织的生物信息学分析 利用UALCAN数据库获取GMNN、RFC4 mRNA和蛋白在人子宫内膜癌组织中的表达情况。在数据库右上角中选择TCGA “TCGA Gene analysis”，“Enter gene symbol(s)”中输入目的基因GMNN、RFC4，“TCGA dataset”中选择“Uterine Corpus Endometrial Carcinoma”，然后Explore选择“Expression”即可获得图片结果。GMNN、RFC4蛋白结果的获取在右上角选择CPTAC即可，其余步骤同上。

1.2.1.2 子宫内膜癌组织与癌旁组织的PCR分析 使用TRIzol试剂盒提取组织总RNA，逆转录合成cDNA。按照RT-qPCR试剂盒的操作说明进行扩增，引物序列：GMNN上游5′-AGAAAATGAGCTGTCCGCAGG-3′，下游5′-TACAGCGCCTTTCTCCGTTT-3′；RFC4上游5′-GCGGAAACCTGAGGAACGAGCC-3′，下游5′-TGGCAGCTACTCCTCGATCCTTG-3′；内参GAPDH上游5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游5′-TCCCGTTCTCAGCCATGTAGTT-3′。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算GMNN、RFC4 mRNA的相对表达量。实验独立重复3次。

1.2.1.3 正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4蛋白表达 采用免疫组化EnVision法检测。取组织石蜡标本，连续切片，按照试剂盒说明进行染色，染色结果由两位资深病理诊断医师采用双盲法进行判断，取来自5个高倍视野的100个细胞进行判读并评分。GMNN、RFC4定位在细胞核，染色强度计0～3分(无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分)，染色细胞比例计1～4分(≤10%为1分，>10%～50%为2分，>50%～80%为3分，>80%为4分)，以染色强度评分与染色细胞比例相乘，>6为高表达，≤6为低表达。

1.2.2 子宫内膜癌患者预后分析

1.2.2.1 生物信息学分析 利用OncoLnc数据库进行TCGA生存分析，观察GMNN、RFC4 mRNA不同表达水平对子宫内膜癌患者的总生存率的影响。在数据库中输入目的基因GMNN、RFC4，“submit”选择UCEC(子宫内膜癌)中的“Yes Please!”，“Lower Percentile”及“Higher Percentile”均填写“50”(即前50%定义为低表达组，后50%定义为高表达组)，低表达组和高表达组各270例，“submit”后即可获得图片结果。

1.2.2.2 组织标本分析 133例子宫内膜癌患者均获随访，随访截至日期为2021年6月，记录患者的生存情况，计算总生存率。

1.2.3 GMNN与RFC4的相关性分析

1.2.3.1 生物信息学分析 利用GEPIA数据库分析GMNN与RFC4的相关性。在数据库中选择“Correlation”，Gene A及Gene B中输入 “GMNN”与“RFC4”，“TCGA Tumor (Cancer name)”选择“UCEC Tumor”,“Add”，“Plot”后即可得到结果。

1.2.3.2 组织标本分析 采用Spearman等级相关分析133例子宫内膜癌组织中GMNN与RFC4的相关性。

2 结果

2.1 子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4基因表达变化 UALCAN数据库分析结果显示，子宫内膜癌组织(n=546)中的GMNN、RFC4 mRNA表达水平均高于正常子宫内膜组织(n=35)(P均<0.05)，见图1。本课题组RT-qPCR结果显示，GMNN、RFC4 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达分别为2.08±0.43、1.98±0.51，在癌旁组织中的表达分别为1.31±0.39、1.07±0.40。GMNN、RFC4 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达水平均高于癌旁组织(P均<0.05)。

2.2 子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4蛋白表达变化 UALCAN数据库分析结果显示，GMNN及RFC4蛋白在子宫内膜癌组织中(n=546)的表达高于正常子宫内膜组织(n=35)(P均<0.05)，见图2。本课题组免疫组化结果显示，GMNN、RFC4蛋白在子宫内膜癌中的高表达率高于正常子宫内膜组织和不典型子宫内膜组织(P均<0.05)。见表1。进一步分析显示，合并淋巴结转移、FIGO病理分期Ⅲ+Ⅳ期、Ki67表达阳性、p53表达阳性患者的GMNN、RFC4蛋白高表达率分别高于无淋巴结转移、FIGO病理分期Ⅰ+Ⅱ期、Ki67表达阴性、p53表达阴性患者(P均<0.05)。见表2。

注：A为GMNN mRNA在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达比较；B为RFC4 mRNA在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达比较。

注：A为GMNN蛋白在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达比较；B为RFC4蛋白在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达比较。

表1 正常子宫内膜、不典型子宫内膜及子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4蛋白表达比较[例(%)]

2.3 子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4表达对预后的影响 OncoLnc数据库分析结果显示，GMNN及RFC4 mRNA高表达患者的总生存率较低表达患者降低(P均<0.05)，见图3。本课题组中，GMNN、RFC4蛋白高表达患者的总生存率分别为43.0%、43.4%，低表达患者的总生存率分别为89.4%、86.0%。GMNN、RFC4蛋白高表达患者的总生存率低于低表达患者(P均<0.05)。Cox回归分析显示，GMNN高表达、RFC4高表达、淋巴结转移、FIGO病理分期Ⅲ+Ⅳ期、Ki-67阳性是子宫内膜癌患者预后的独立影响因素(P均<0.05)。见表3。

2.4 子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4表达的相关性 GEPIA数据库分析结果显示，子宫内膜癌组织中GMNN与RFC4 MRNA表达呈正相关(r=0.58，P<0.01)。本课题组中，子宫内膜癌组织中GMNN与RFC4蛋白表达呈正相关(rs=0.303，P<0.01)。

3 讨论

正常内膜、不典型增生内膜、内膜癌三者之间是疾病进展的一个过程。正常子宫内膜在长期持续的激素或炎症刺激影响下，子宫内膜会出现细胞异形性，即不典型增生，若不及时治疗，进一步发展就会成为子宫内膜癌。子宫内膜不典型增生是子宫内膜癌的癌前病变，约1/3左右会发展为内膜癌。子宫内膜癌预后不佳，仅依赖常规化疗或临床手术无法解决子宫内膜癌患者尤其是晚期患者的高病死率。虽然目前免疫疗法、RNA疗法等多种疗法联合为其治疗提供了一种有前景的临床策略，但能够有效治疗子宫内膜癌的靶向药物目前并不多见。GMNN一种多功能蛋白质，可抑制细胞增殖S期的DNA复制，防止基因组不稳定性，并防止化学诱导的致癌作用。GMNN通过控制细胞周期内DNA复制的重新启动来维持基因组保真度[3]，并可调节HBO1影响的DNA复制[2]，其复制起始因子Cdt1表达水平的不平衡可导致DNA复制缺陷从而导致癌症的发生[4-5]。GMNN在胃癌、肠癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤组织中过度表达[6]，表明其具有致癌作用。

表2 不同临床病理参数子宫内膜癌患者GMNN、RFC4蛋白表达比较[例(%)]

注：A为GMNN不同表达水平患者的生存时间比较；B为RFC4不同表达水平患者的生存时间比较。

这种致癌作用的机制包括在早期细胞谱系中维持多能性的能力[7]、促进胚胎干细胞中的上皮间质转化(EMT)[8]和在G2/M/G1早期控制胞质分裂的能力[9]。大量研究显示，GMNN表达水平越高，肿瘤细胞的生长速度越快，侵袭能力越强，患者生存时间越短[10-12]，因此有学者认为GMNN可作为肝癌诊断的生物标志物[13]。RFC复合体位于真核生物复制叉上，由RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5亚基构成，在DNA损伤后的真核DNA复制和DNA修复活动中发挥重要作用[14]。RFC4与RFC2、RFC5亚基形成核心复合物，具有DNA依赖性ATP酶活性，在体外系统中发现，该活性受PCNA刺激，是DNA聚合酶δ和DNA聚合酶ε延伸引物DNA模板所必需的[15]。RFC4在肺癌、口腔舌鳞癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等多种癌症中高表达，其致癌作用与肿瘤细胞增殖及侵袭密切相关[16]。本研究利用UALCAN数据库分析子宫内膜癌组织中的GMNN、RFC4 mRNA和蛋白表达水平，结果显示，GMNN、RFC4mRNA和蛋白在子宫内膜癌组织中的表达均高于正常子宫内膜组织；进一步采用RT-qPCR方法对子宫内膜癌患者的新鲜癌组织和癌旁组织中的GMNN、RFC4 mRNA表达进行检测，结果显示，GMNN、RFC4 mRNA在子宫内膜癌组织中的表达水平均高于癌旁组织；采用免疫组化方法检测正常内膜、不典型增生内膜、内膜癌组织中的GMNN、RFC4蛋白表达，结果显示，GMNN、RFC4蛋白在子宫内膜癌中的高表达率明显高于不典型子宫内膜组织和正常子宫内膜组织。这提示MNN、RFC4 mRNA和蛋白表达可能与子宫内膜癌的发生有关，二者高表达促进了子宫内膜癌的发生。进一步分析GMNN、RFC4与子宫内膜癌临床病理参数之间的关系，结果显示合并淋巴结转移、FIGO病理分期Ⅲ+Ⅳ期、Ki67表达阳性、p53表达阳性患者的GMNN、RFC4高表达率分别高于无淋巴结转移、FIGO病理分期Ⅰ+Ⅱ期、Ki67表达阴性、p53表达阴性的患者，表明GMNN和RFC4表达与子宫内膜癌的FIGO病理分期、淋巴结转移、Ki67蛋白表达水平、p53蛋白表达水平有关，提示GMNN及RFC4的高表达均可促进人子宫内膜癌的恶性进展。

表3 子宫内膜癌患者的术后单因素和多因素生存分析

子宫内膜癌作为常见的妇科恶性肿瘤，大多数患者手术后生存时间短，预后差。本研究采用OncoLnc数据库分析子宫内膜癌组织中GMNN、RFC4 mRNA表达对预后的影响，结果显示，GMNN及RFC4 mRNA高表达患者的总生存率较低表达患者降低；本课题组对子宫内膜癌患者的随访结果显示，GMNN、RFC4蛋白高表达患者的总生存率低于低表达患者，提示二者的高表达与内膜癌患者的总生存率均密切相关，两者的表达情况可提示子宫内膜癌患者的术后生存率；Cox回归分析显示，GMNN、RFC4蛋白高表达是子宫内膜癌患者预后的独立影响因素，二者与内膜癌患者的预后密切相关，可作为内膜癌患者预后的独立预测因子，GMNN和RFC4表达越高，子宫内膜癌患者的预后越差。

最新对斑马鱼的研究显示，GMNN通过影响Fgf8和Notch信号通路，以调节体节发生过程中的体节分割[17]；对斑马鱼和小鼠的研究发现，GEMC1作为GMNN家族的一员，是多纤毛细胞分化程序的关键上游介质，在Notch抑制时被激活[18]。而另有研究显示，RFC4是Notch1信号传导的全新直接转录靶点[19]。我们推测，GMNN与RFC4的相互作用可能与Notch信号通路有一定的关系，但具体作用机制尚不清楚。本研究先通过生物信息学分析GMNN与RFC4 mRNA表达的相关性，结果显示，GMNN与RFC4 mRNA表达呈正相关；然后对子宫内膜癌组织中GMNN与RFC4蛋白表达进行相关性分析，结果显示二者呈正相关，进一步验证了上述结果。推测二者可能协同表达，共同促进内膜癌的恶性生物学行为。

综上所述，GMNN、RFC4 mRNA及蛋白在子宫内膜癌组织中的表达升高，且二者表达呈正相关；GMNN、RFC4高表达与子宫内膜癌的恶性程度、进展情况有关，严重影响患者的术后生存率。因此认为，GMNN及RFC4与子宫内膜癌的恶性生物学行为密切相关，两者极有可能成为今后病理诊断和治疗子宫内膜癌的新的分子指标。关于GMNN与RFC4相互作用的具体机制目前尚并不明确，有待我们从细胞学及分子遗传学水平进一步深入研究。