翁晨祎,孟 林,叶来生,翁华宏

(1.广西中医药大学瑞康临床医学院,广西 南宁 530011；2.广西骨伤医院关节科,广西 南宁 530012)

骨关节炎是一种以关节疼痛、压痛、活动受限、畸形为主要特征的关节退行性疾病,其病因尚未完全明确,多与年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传易感性等有关。流行病学调查显示,骨关节炎好发于中老年人群,在65岁以上的人群中超过50%为骨关节炎患者[1]。目前骨关节炎的治疗主要通过应用非甾体抗炎药和镇痛药、局部使用皮质类固醇和黏性补充剂,控制疼痛和改善关节功能,但存在引发上消化道、脑、肾、心血管疾病的风险[1]。相比于上述治疗方法,中医药治疗骨关节炎具有简便易行、价格低廉、副作用小的优势[2]。蠲痹汤出自《医学心悟》,由当归、独活、肉桂、秦艽、海风藤、羌活、川芎、桑枝、乳香、甘草、木香组成,主治风寒湿三气合而成之痹者,对治疗骨关节炎具有较大的优势及潜力[3]。但蠲痹汤为中药复方,成分、靶点较为复杂,其治疗骨关节炎的机制尚未阐明。网络药理学是从药物、靶点和疾病之间的相互关系出发,进行体外虚拟筛选潜在的药物活性成分、作用靶点、信号通路,构建“药物—靶点—疾病”的网络联系,初步预测药物的药效物质基础和作用机制的学科[4]。分子对接是一项通过计算机程序辅助来预测大分子受体和小分子配体之间的结合模式及亲和力的技术[5]。本研究基于网络药理学和分子对接技术,借助网络生物、药物数据库,预测蠲痹汤治疗骨关节炎的关键成分、核心靶点和主要通路,构建“活性成分—治疗靶点”的网络关系图,分析蠲痹汤潜在的作用机制,以期为未来实验研究及与其他临床治疗手段联合使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 蠲痹汤活性成分与作用靶点的筛选

以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18作为药物活性成分的筛选指标,在TCMSP数据库检索筛选出当归、独活、肉桂、秦艽、海风藤、羌活、川芎、桑枝、乳香、甘草、木香这11味中药复方的活性成分,并通过TCMSP数据库检索筛选出中药复方活性成分的对应靶点。将上述得到的靶点名称通过Uniprot数据库和Perl语言软件(版本5.30.0.1)进行处理转化为靶基因名称。

1.2 骨关节炎治疗靶点的筛选

通过OMIM数据库、GeneCards数据库、PharmGkb数据库和TTD数据库,以“osteoarthritis”为检索关键词,检索骨关节炎的治疗靶点。汇总4个数据库的靶点数,应用R语言软件(版本4.0.2)合并去重得到骨关节炎的治疗靶点。

1.3 蠲痹汤交集治疗靶点的筛选

利用R语言软件绘制药物药效靶点与疾病治疗靶点的交集映射,得到“蠲痹汤—骨关节炎”交集靶点以及venn图。

1.4 蠲痹汤“活性成分—治疗靶点”网络图绘制

利用Cytoscape软件(版本3.8.0)构建“活性成分—治疗靶点”的网络图,中药成分以节点1表示,治疗靶点以节点2表示,连线表示相互作用的关系。将连线交集数量前5的活性成分作为本研究的关键活性成分。

1.5 蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络的构建及核心靶点的筛选

将蠲痹汤—骨关节炎的交集靶点导入String数据库,以置信度得分>0.9分为条件筛选,并删除图中游离的蛋白节点,绘制PPI网络图。运用Cytoscape软件中CytoNCA插件对PPI网络进行分析,根据连接中心度、间距中心度、靠近中心度、特征向量中心度、网络核心地位性和局部边距连接度等指标进行筛选,首先筛选出在每个指标中大于中位值的靶点,得到次级核心靶点。将上述靶点再次进行筛选,得到蠲痹汤治疗骨关节炎的核心靶点。

1.6 基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析

利用R语言软件将交集靶点基因转换为entrezID后,按照P<0.05对其进行过滤和富集分析,得到GO富集分析和KEGG富集分析的具体数据,并分别绘制barplot柱状图。

1.7 分子对接

将“活性成分—治疗靶点”网络图中连线交集数量前5的活性成分与其对应的12个核心靶点进行分子对接(活性成分对应的治疗靶点中若不包含筛选出的核心靶点则不与其进行分子对接),取最低连结自由能作为分子对接的结果,药物小分子配体和靶点蛋白受体结合能越低,则配体和受体的结合力越强[5]。首先,通过PubChem数据库获取活性成分的小分子配体2D结构,利用ChemBioOffice Ultra软件(2014版)将2D结构转换为3D结构；然后,通过RCSB PDB平台数据库获得靶点的蛋白受体结构,利用PyMOL软件(版本2.4.0)优化去除水分子和小分子配体,利用AutoDockTools软件(版本1.5.6)、AutoDockVina软件(版本1.1.2)将配体、受体格式转换为pdbqt格式,并确定活性口袋进行分子对接；最后，利用PyMOL软件(版本2.4.0)输出图像文件。

2 结果

2.1 蠲痹汤活性成分及靶点筛选

通过TCMSP数据库共得到蠲痹汤活性成分165个；中药复方的对应靶点共9 635个,见表1。利用Perl语言软件筛选出中药复方中活性成分的对应靶点共2 529个。

表1 蠲痹汤“中药—活性成分—靶点基因”(个)

2.2 蠲痹汤治疗骨关节炎的治疗靶点

本研究共得到疾病治疗靶点1 844个,同时将药物药效靶点和疾病治疗靶点取交集得到115个交集靶点,利用R语言软件输出venn图(图1)。

图1 蠲痹汤与骨关节炎的疾病靶基因交集

2.3 蠲痹汤“活性成分—治疗靶点”网络图构建

将得到的115个交集靶点与165个活性成分输入Cytoscape软件,构建“活性成分—治疗靶点”网络,见图2。根据连线交集数量分级排序,排序前5的活性成分为槲皮素(连线交集数量83)、山柰酚(连线交集数量32)、柚皮素(连线交集数量21)、甘草酮A(连线交集数量18)、刺芒柄花素(连线交集数量15)。提示这5个活性成分可能为蠲痹汤治疗骨关节炎的关键活性成分。

注：外圈圆形代表靶点,内部圆形代表活性成分,矩形代表药物

2.4 PPI网络的构建和核心靶点的筛选

本研究共得到PPI的节点105个,边476条(边表示靶点蛋白的互作关系),见图3a。将绘制的PPI网络导入Cytoscape软件,利用CytoNCA插件对PPI网络进行筛选,经过两次筛选得到核心靶点12个,见图3b。

a：蠲痹汤PPI网络图；b：PPI网络核心靶点筛选

2.5 GO富集分析

GO富集分析共得到2 519个条目(P<0.05),其中生物过程2 306个,分子功能144个,细胞组成69个。在GO富集分析中,蠲痹汤治疗骨关节炎的生物过程主要体现为脂多糖反应、细胞的氧化应激反应、活性氧类反应等；分子功能主要体现为细胞因子受体结合、蛋白酶结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性等；细胞组成主要体现为薄膜筏、胞质囊腔、转录调节复合物、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等,取生物过程、分子功能、细胞组成中基因富集程度排名前10的条目制成柱状图,见图4。

图4 交集靶点GO富集分析柱状图

2.6 KEGG富集分析

KEGG富集分析共得到162条信号通路(P<0.05),列举排名靠前的30条通路(图5)以及富集程度排名前5的关键通路所涉及的基因,主要为AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路(表2)。IL-17信号通路是在蠲痹汤治疗骨关节炎过程中联系最为广泛的通路,以此为例在该通路中标记蠲痹汤治疗骨关节炎发挥调控作用的靶点(图6)。

图5 交集靶点KEGG富集分析柱状图

注：红色为上调,绿色为下调

表2 蠲痹汤治疗骨关节炎前5条关键通路涉及的基因分布

2.7 分子对接

5个关键活性成分和与之有映射的12个核心靶点的结合能均<-6 kcal·mol-1(表3),表明蠲痹汤治疗骨关节炎的关键活性成分能与其对应的核心靶点稳定结合。将结果输入PyMOL软件,优化图形并输出分子对接3D图形,白色为小分子配体,其余为蛋白受体,选择结合能最高的甘草酮A和STAT3进行分子对接作为示例,见图7。

表3 活性成分与核心靶点结合能(kcal·mol-1)

图7 甘草酮A和STAT3的分子对接图

3 讨论

3.1 骨关节炎的中医治疗

中医认为“骨痹”有两个重要成因：一为风邪、寒邪、湿邪外邪作祟,外邪致气血瘀塞不通,故而导致痹症；二为七情内伤内因所困,其内情志不舒则气血运行不畅而致痹症。蠲痹汤具有祛风除湿、蠲痹止痛的功效[6]。在近年的临床研究中,蠲痹汤对治疗“骨痹”有着较好的疗效,并且应用也逐渐广泛[3],但其潜在的药理学机制尚未明确,因此,本研究通过运用网络药理学方法和分子对接技术来探讨蠲痹汤治疗骨关节炎的潜在药理学机制。

3.2 蠲痹汤通过抗炎、抗凋亡、调控软骨细胞代谢和促进软骨下骨重建等治疗骨关节炎

本研究通过构建“活性成分—治疗靶点”网络图,筛选出槲皮素、山柰酚、柚皮素、甘草酮A、刺芒柄花素可能为蠲痹汤治疗骨关节炎的关键活性成分，通过PPI网络的构建与核心靶点的筛选,得到STAT3、TNF、MAPK14等12个有潜力治疗骨关节炎的核心靶点。

在骨关节炎的病理进程中,始终围绕着几个密不可分的因素：炎症反应、软骨的破坏、软骨下骨重建以及软骨细胞的代谢与凋亡[7],而本研究筛选出的5个关键活性成分在这一病理进程中分别能起到不同的作用。首先,软骨细胞的凋亡是骨关节炎的主要诱因之一,而氧化应激和内质网应激则会介导细胞凋亡[8]。一项骨关节炎大鼠模型研究表明,槲皮素抗凋亡效应中的一个潜在机制是能通过调节SIRT1-AMPK信号通路抑制氧化应激诱导的内质网应激反应,从而在一定程度上减缓软骨细胞凋亡[8]。炎症反应除了会促进软骨细胞的凋亡,也会促进骨关节炎的进展。在多种促炎因子的影响下,骨关节炎患者的软骨细胞和软骨微环境会发生改变,从而导致软骨细胞功能障碍[9]。山柰酚除了具有抗细胞凋亡的作用外[10],还可预防脂多糖引起的炎症反应,其作用机制可能与山柰酚下调miR-146a保护软骨ATDC5细胞免受脂多糖介导的炎症反应,以及抑制核心蛋白聚糖的表达有关[11]。而在抗炎作用方面,有研究表明甘草酮A可以通过激活Nrf2信号通路介导抑制IL-1β诱导的炎症反应[12]。另有研究表明,刺芒柄花素能有效拮抗IL-1β诱导的分解代谢,通过抑制软骨降解酶、炎症介质、促炎细胞因子来延缓关节软骨退变的进展,从而发挥治疗骨关节炎的作用[13]。在动物实验研究构建的小鼠骨关节炎模型中,柚皮素被证明可通过调节NF-κB通路来抑制MMPs介导的关节软骨退变,从而减轻骨关节炎的症状[14]。本研究PPI网络表明，TNF、STAT3可能是蠲痹汤治疗骨关节炎的核心靶点。TNF作为骨关节炎的主要致炎细胞因子,与推动炎症级联反应有关[7,15]。在STAT3信号通路诱导软骨细胞分解代谢过程中,STAT3为IL-6下游的主要信号因子,可促进MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4以及ADAMTS-5的表达,从而加速软骨退化[15]。IL-6是人软骨细胞中NF-κB通路的直接靶基因,而柚皮素可以通过此通路发挥治疗骨关节炎的作用[14]。因此,蠲痹汤可能通过柚皮素作用于NF-κB通路并下调IL-6来抑制STAT3信号因子,进而延缓软骨退化进程,达到治疗骨关节炎的目的。基于以上结果可推测,蠲痹汤主要通过槲皮素、山柰酚、甘草酮A、刺芒柄花素和柚皮素发挥抗凋亡、抗炎、调控软骨细胞代谢等作用，从而实现对骨关节炎的治疗。同时,结合本研究“活性成分—治疗靶点”网络可以发现,不同活性成分有共同的治疗靶点,且不同靶点之间存在复杂的关联。蠲痹汤治疗骨关节炎并不是通过单一靶点或单一活性成分发挥调控作用,而是在“多成分—多靶点”共同调控下治疗骨关节炎。本研究中蠲痹汤的5个关键活性成分和与之有映射的12个核心靶点对接的结合能均<-6 kcal·mol-1,说明该中药复方的关键成分与其核心靶点有较好的结合能力,可稳定地协同发挥治疗作用。

本研究KEGG富集分析结果显示,蠲痹汤和多条信号通路有关,其中与骨关节炎相关的主要有TNF信号通路、IL-17信号通路、PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、AGE-RAGE信号通路。TNF信号通路可通过调控NF-κB和MAPK两条关键信号通路减少炎症因子的分泌,从而延缓骨关节炎的进展[16]。IL-17信号通路则可通过调控IL-17来减缓MMPs的合成以及IL-6的产生,从而在一定程度上阻止软骨被破坏[17-19]。而p38-MAPK则被认为可能是IL-17和TNF-α之间协同信号的靶点[20],除了影响转录和RNA的稳定性,还可能会影响染色质重塑、细胞因子分泌和其他基因或蛋白水平的调节,对软骨下骨重建起着关键作用[21]。因此,通过调控IL-17信号通路可减少炎症因子和蛋白水解酶的合成,并促进软骨下骨重建,对于延缓和治疗骨关节炎具有重要作用。PI3K-AKT-mTOR信号通路在延缓炎症、调节软骨细胞凋亡等方面起着关键作用[22]。PI3K激活可导致下游AKT磷酸化,进而调节Bax、Bcl-2和caspase-3等凋亡相关因子的表达[23]。mTOR是AKT的下游靶点和自噬的负调节因子[24],且mTOR通路的失活会诱导自噬,这对细胞的新陈代谢和稳定性至关重要[25-26]。因此,通过调控PI3K-AKT信号通路可以下调该通路相关凋亡因子并诱导自噬，清除软骨细胞受损的细胞器和长效大分子,维持软骨细胞内稳态,增加基质合成,从而减缓骨关节炎进展。在HIF-1信号通路中,有研究认为HIF-1α诱导自噬的机制可能与调控Beclin-1/Bcl2复合体以及AMPK酶的激活有关,从而抑制mTOR[27-28]。自噬除了上述提到的作用,也可能通过作用于线粒体代谢从而减少相关氧化应激反应，因此恢复自噬也可以被认为是一定程度上延缓了骨关节炎的发展[26，29]。有研究发现,肥胖能够引起炎症反应,并且增加2型糖尿病发生的风险,AGE-RAGE信号通路中的关键成分AGEs及RAGE则被认为是引起糖尿病以及促进炎症发展的关键因素之一[30-32]。糖尿病会损害骨细胞的新陈代谢和功能[33],但是肥胖与骨关节炎之间的具体机制尚不完全清楚。有研究表明,机械因素和代谢因素是骨关节炎的主要诱因,肥胖患者的骨关节长时间暴露于沉重的机械压力下,负荷增加会抑制软骨基质的合成,并诱导促炎因子和Ca2+-ERK-NF-κB信号通路,加快骨关节炎的进展[34]。因此,蠲痹汤通过调控AGE-RAGE信号通路来治疗肥胖患者代谢性骨关节炎值得进一步研究。以上结果显示,蠲痹汤可通过调控TNF信号通路、IL-17信号通路、PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、AGE-RAGE信号通路参与抗凋亡、抗炎、调控软骨细胞的代谢和促进软骨下骨重建,从而发挥对骨关节炎的治疗作用。同时,结合本研究排名前5的关键通路所涉及的基因和IL-17信号通路图可以发现，治疗骨关节炎的同一靶点在不同通路中都起着调控作用,由此可以推测,蠲痹汤可能通过多靶点、多通路协同发挥治疗作用。

3.3 中药与组织工程研究

近年来中药(包含蠲痹汤在内的众多复方)联合应用组织工程技术能很好地解决单独应用组织工程技术时出现的部分问题[35]。而基于网络药理学和分子对接技术的探究则可以为找到合适的中药复方提供指导。

间充质干细胞是一种多能基质细胞,能够自我更新并分化为间充质组织谱系,包括骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉和骨髓基质,是组织工程中理想的软骨修复种子细胞[36-37]。目前,间充质干细胞已被证明对骨关节炎有较好的临床疗效[38],但也存在软骨修复率低、软骨细胞表型不稳定、异体移植排斥等问题[37]。IL-35是新近发现的一种细胞因子,其可通过增强调节性T细胞的功能,抑制辅助性T细胞1和辅助性T细胞17的增殖能力,发挥免疫抑制作用,有IL-35表达的间充质干细胞有望成为治疗同种异体移植排斥反应的新途径[39]。有研究表明,蠲痹汤在治疗局部炎症的同时还能够提高IL-35的水平[40]。在下一步的临床试验中,蠲痹汤联合间充质干细胞异体移植修复骨关节软骨损伤将会是一个新的可行的研究思路。

3.4 小结

综上所述,蠲痹汤可能通过多成分、多靶点、多通路的相互作用发挥对骨关节炎的治疗作用。这为蠲痹汤下一步的基础研究及临床应用提供了新的研究思路。本研究也存在以下不足：由于中医辩证论治的特点,蠲痹汤治疗不同证型骨关节炎的具体剂量比例会有变化,进而在一定程度上会导致功效不同；未收集到足够临床数据将骨关节炎模型进一步细化,将不同证型与不同方药剂量进行对应加权处理。中药复方并不是简单的单个活性成分的叠加,而是多成分—多靶点的协同作用,多个活性成分之间的协同作用以及活性成分对靶点的激活或抑制都需要发展相对应的网络算法来进行量化标准[41],这将是网络药理学未来需完善的方向。相信随着人工智能、网络药理学和分子对接技术的日趋进步,中药及其复方能更好地与组织工程相结合运用于临床。