梁苏育 袁峰

致病性弧菌[1-2]是危害水产品的重要因素，是炎天秋日临海地区引发食物中毒的首要病原菌。应对这类公共卫生问题[3]的关键是检出食物中毒样品中的致病性弧菌。目前，对病原微生物检验最传统最常用的方法是病原体分离培养法，它也是检验方法中的“金标准”[4]，而选择科学有效的培养基至关重要。本研究通过将13株标准菌株，以及其中4株弧菌标准菌株的混合菌接种在硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar，以下简称TCBS平板）、改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E琼脂（modified cellobiose-polymyxin b-colistin agar，以下简称mCPC平板）和弧菌筛选显色平板等3种弧菌培养基上培养，观察它们的生长效果，来分析和比较3种弧菌培养基的筛选性能，为快速准确确定致病性弧菌、提高检验质量[5]提供可靠保证。

1 材料与方法

1.1 培养基

硫代硫酸钠-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂（TCBS）、改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）琼脂、弧菌筛选显色平板和3%氯化钠碱性蛋白胨水均由上海科玛嘉微生物技术有限公司提供；营养肉汤培养基由北京三药科技开发公司提供。

1.2 标准菌株

副溶血性弧菌（CICC 21617）、大肠埃希氏菌（ATCC 25922）、致病性大肠埃希氏菌（CICC 10372）、产肠毒素大肠埃希氏菌（ATCC 35401）、乙型副伤寒沙门氏菌（ATCC 14028）、宋内痢疾志贺氏菌（ATCC 9290）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、蜡样芽胞杆菌（ATCC 11778）和单核细胞增生李斯特菌（ATCC 19115）均由北京陆桥技术股份有限公司提供；创伤弧菌（ATCC 27562）、溶藻弧菌（ATCC 33787）和河流弧菌（ATCC 33809）均由无锡赛微生物技术有限公司提供。

1.3 仪器设备

恒温培养箱（SLI-700）、生物安全柜（SG403CE）、比浊仪（生物梅里埃）。

1.4 方法

1.4.1 纯菌的培养 副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌均用3%氯化钠碱性蛋白胨水复苏，大肠埃希氏菌、致病性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、宋内痢疾志贺氏菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特菌均用营养肉汤复苏，复苏24 h后，用10 μL接种环各挑取1环，分别划线接种在TCBS平板、mCPC平板和弧菌筛选显色平板上，置（36±1）℃恒温培养箱内，培养18～24 h，观察各个标准菌株在3种培养基上的生长情况。

1.4.2 混合菌的培养 用3%氯化钠碱性蛋白胨水分别将副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌的复苏液稀释成相同浊度的菌悬液，再分别从中各取0.5 mL，放入同一个无菌试管中，均匀混合，然后用10 μL接种环各挑取1环，分别划线接种在TCBS平板、mCPC平板和弧菌筛选显色平板上，置（36±1）℃恒温培养箱内，培养18～24 h，观察每种弧菌标准菌株在3种培养基上的生长情况。

1.4.3 个别弧菌的再一次培养 1.4.1中创伤弧菌和河流弧菌的复苏液在TCBS平板上培养18～24 h后，分别用10 μL接种环各挑取单个菌落和刮取多个菌落，划线接种在弧菌筛选显色平板上，置（36±1）℃恒温培养箱内，培养18～24 h，观察2种弧菌标准菌株在弧菌筛选显色平板上的生长情况。

2 结果

2.1 13株标准菌株分别在3种培养基上的生长情况

13株标准菌株分别在3种培养基上的生长情况见表1。结果表明TCBS平板对致病性弧菌的选择范围很广，选择效率较高，是非特异性的，4株弧菌标准菌株均生长良好，大部分杂菌受抑制，只有个别细菌生长良好，比如：肺炎克雷伯菌；mCPC平板对创伤弧菌的选择性最强，只有创伤弧菌生长良好，其余均被抑制；弧菌筛选显色平板对副溶血性弧菌和溶藻弧菌的选择性强，其余均被抑制。

表1 13株标准菌株分别在3种培养基上的生长情况

2.2 混合菌在3种培养基上的生长情况

混合菌在3种培养基上的生长情况见表2。结果显示TCBS平板上，在相同浓度下，发酵蔗糖的溶藻弧菌生长占优势，易造成假阴性；mCPC平板能很好地促进创伤弧菌的生长，并且菌落典型单一，纯度高；弧菌筛选显色平板对副溶血性弧菌具有较好的特异性，副溶血性弧菌菌落显紫红色，根据颜色不同容易辨别。

表2 4株弧菌标准菌株的混合菌在3种培养基上的生长情况

2.3 2株弧菌标准菌株在弧菌筛选显色平板上的生长情况

2株弧菌标准菌株在弧菌筛选显色平板上的生长情况见表3。结果说明活力强的创伤弧菌和河流弧菌才能在弧菌筛选显色平板上生长，而且河流弧菌长势不好。

表3 2株弧菌标准菌株在弧菌筛选显色平板上的生长情况

3 讨论

TCBS平板成分中的胆酸钠、牛胆汁粉、硫代硫酸钠与柠檬酸钠及较高的PH可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群，而碱性环境又能促进致病性弧菌的生长，成分中的蔗糖是可发酵的糖类，是重要的鉴别剂，本研究中4株弧菌标准菌株均生长良好，5株革兰氏阴性菌和3株革兰氏阳性菌都受到抑制[6]，对致病性弧菌而言，它是非特异性的平板，且选择效率较高。为使实验数据更具参考价值，本研究在传统观念选取对照杂菌的基础上补充肺炎克雷伯菌，结果发现肺炎克雷伯菌不受抑制，需引起重视，因为肺炎克雷伯菌可存在于健康人的呼吸道和肠道中、自然界水和谷物中，所以检测致病性弧菌的样品中有可能混有。它能发酵蔗糖，菌落呈黄色，与某些发酵蔗糖的弧菌菌落相似，可造成假阳性。另外，从混合菌的培养结果可知，TCBS平板还存在其它弊端，当培养基上生长着一定量的蔗糖发酵阳性[7-9]的细菌时，尤其是生长速度快的溶藻弧菌时，会受到干扰。它们产生的酸会随着时间的延长而扩散，导致这些菌落周围的琼脂甚至整个培养基颜色由蓝绿色变为黄色，当这些菌落附近的非发酵蔗糖菌菌落被黄色色素覆盖时，如：副溶血性弧菌和创伤弧菌的菌落颜色会由蓝绿色变为黄绿色或者黄色，易造成假阴性，从而降低了TCBS平板对非发酵蔗糖菌的检出率。而且，它也不能有效地区分副溶血性弧菌和与其生化特点相似的创伤弧菌等。因此，TCBS平板适合样品中致病性弧菌的初步分离或者致病性弧菌含量较低的样品的分离。

mCPC平板中的多黏菌素B和多黏菌素E能抑制副溶血性弧菌、溶藻弧菌和河流弧菌等非目标菌及其它杂菌的生长，纤维二糖为可发酵的糖类，创伤弧菌是致病性弧菌中个别能利用纤维二糖作为自己碳源的弧菌，它发酵纤维二糖，促进生长，产生酸，使培养基PH下降，酸碱指示剂变色，菌落呈黄色，就创伤弧菌来说，mCPC平板选择性很强，或者说特异性较高，从混合菌的培养结果：菌落典型单一纯度高，也可以证明这一特点。由此可见，mCPC平板适合样品中创伤弧菌的分离，也适合样品中创伤弧菌菌株的纯化[10]。不过，据文献报道，E型创伤弧菌在此培养基上呈假阴性。

弧菌筛选显色平板主要通过在培养基中加入特异性酶的显色底物，依据菌落显现出的颜色为菌种进行初步的鉴别，简化了对菌株进行纯培养和生化鉴定的步骤[11-12]，较明显地提升了检测效率，它里面的抑菌剂可抑制大部分非弧菌，显然，它可作多种弧菌培养鉴别，特异性强，特别针对副溶血性弧菌（紫红色菌落）效果尤佳，易生长的溶藻弧菌只显平板颜色，即使量多也不能干扰，混合菌的培养结果可证实这一点。本研究还发现弧菌筛选显色平板对创伤弧菌和河流弧菌也存在抑制，活力强的菌株才能生长，菌落形态和颜色不同，好分辨，相关文献报道只是表述这两种弧菌可以在弧菌显色平板上生长，并未进一步提及活力强的菌株，因而，本研究的结果更具有应用方面的参考价值。综上所述，弧菌筛选显色平板适合样品中副溶血性弧菌的分离，亦适合获取样品中活力强的创伤弧菌和河流弧菌。

由于本实验室保藏的弧菌标准菌株品种有限，在3种培养基上的数据不够全面，需要今后进一步完善，这是本研究存在的局限性。

随着科技突飞猛进地发展，免疫学技术和分子生物学技术，逐步应用到病原微生物检验中，致使检测的灵敏性和特异性上升，检验效率提高，尤其是高通量检验技术当属近年发展起来的前沿技术，应用前景非常广阔。