周奇妙 彭阿建 张 熙 朱芙蓉 谭梅鑫 王晓琴 彭佳蕊 熊 武

1.湖南中医药大学第一附属医院烧伤整形科，湖南长沙 410007；2.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南长沙 410208；3.湖南中医药大学临床医学院，湖南长沙 410007

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种可以多向分化的成体干细胞，具有很强的修复重建能力，可以促进内皮细胞增殖和迁移，甚至在特定环境下可分化为内皮细胞，促进损伤部位的血管再生和内皮重建[1]。目前关于MSCs 参与血管新生的研究已成为血管新生领域的研究热点，而这与其细胞活性和增殖能力关系紧密。现已有研究发现，中药干预可提高MSCs 的活性和增殖能力，有助于MSCs 发挥促进血管新生的作用[2-3]。现代药理研究表明，人参含人参皂苷（ginsenoside，GS）Ro、Rb1、Re、Rg1 等多种皂苷类成分，以及多糖、氨基酸、黄酮类等，其中GS-Rg1 为其主要活性成分之一[4]。GS-Rg1 具有降血糖[5]、降血脂[6]、促血管新生[7]、抗氧化应激[8]、减轻炎症反应[9]等作用。目前关于GS-Rg1 发挥血管新生作用的研究主要集中在血管内皮细胞，而针对GS-Rg1 是否能通过诱导非内皮细胞促进血管新生的研究鲜有报道。本研究将GS-Rg1 联合具有血管内皮分化潜能的人脐血MSCs 进行细胞活性和体外成血管分化研究。

1 材料与方法

1.1 主要药品试剂

胎牛血清（10270-106），购自美国GIBCO；抗血小板-内皮细胞黏附分子-1（anti-platelet endothelial cell adhesion molecule-1，anti-CD31）抗体（ab28364），抗血管性血友病因子（anti-von Willebrand factor，antivWF）抗体（ab154193），山羊抗小鼠IgG H&L（异硫氰酸荧光素）（ab6785），购自英国Abcam；CCK-8 试剂盒（C0037），购自上海碧云天生物技术研究所；DMEM/F12 培养基（SH30023.01B）、磷酸盐缓冲液（SH30256.01B），购自美国Hyclone；Matrigel 基质胶（354234），购自美国BD BioCoat；成骨诱导分化培养基（HUXMA-90021），成脂诱导分化培养基（RASMD-90031），购自美国Cyagen；成软骨诱导分化培养基试剂盒（HUXUB-90042），购自美国OriCell；DAPI 染液（D9542）、油红O 溶液（O1391-250ML）、茜素红染液（130-22-3RT），购自美国Sigma；阿利新蓝染液（MAS0981），购自中国MesGen；抗人CD44 抗体（异硫氰酸荧光素）（338803）、抗人CD73 抗体（藻红蛋白）（344003）、抗人CD105 抗体（别藻蓝蛋白）（323207），购自美国Biolegend。

1.2 主要仪器

CO2培养箱（XD-101），日本SANYO；生物倒置显微镜（BX51），日本OLYMPUS；台式低速离心机（5804R），德国Eppendorf；热电酶标仪（MK3），美国Thermo；共聚焦显微镜（LSM800），德国蔡司。

1.3 研究方法

1.3.1 人脐血MSCs 的培养和鉴定 无菌条件下取足月健康新生儿脐带血10 ml（标本采集获得产妇和家属同意，签署知情同意书并获湖南中医药大学第一附属医院伦理委员会同意，批准文号：HN-LL-KY-2020-013-01），用密度梯度离心得到单个核细胞，移入含5%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12 培养基中，放在37℃培养箱中培养24 h 后换液，去除漂浮细胞，换培养液，继续培养至第7 天，细胞生长达90%融合时进行传代培养，每隔2 d 换液1 次。取第3 代人脐血MSCs 于光学显微镜下观察细胞形态，取第4 代分别进行成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定。

1.3.2 最佳浓度GS-Rg1 的确定 收集对数生长期人脐血MSCs，胰酶消化后调整细胞悬液浓度，置于96 孔板中，1×105个/孔；在37℃、5%CO2温箱中培养24 h，待细胞贴壁。在96 孔板中配制100 μl 的细胞悬液，将培养板在37℃，5%CO2的培养箱预培养24 h；然后向培养板分别加入0、5、10、20、40、80 mg/L GS-Rg1 与人脐血MSCs 进行联合培养。经孵育48 h 后，依据CCK-8 试剂盒说明书要求，用酶标仪测定各浓度下细胞在450 nm 处的光密度（optical density，OD）值，并设置对照孔，每组设定3 个复孔，筛选出GS-Rg1 促人MSCs 增殖的最佳浓度。

1.3.3 实验分组 将第4 代人脐血MSCs 分为实验组和对照组，实验组用最佳浓度的GS-Rg1 处理；对照组用等体积的磷酸盐缓冲液处理。

1.3.4 GS-Rg1 对人脐血MSCs 细胞活性的影响 将细胞置于37℃、5%CO2温箱培养24 h，使细胞贴壁。取处于指数生长期的细胞接种到96 孔板上，实验组中加入最佳浓度的GS-Rg1，对照组用等体积磷酸盐液处理，将96 孔板中配制100 μl 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24 h，再孵育24 h，向每孔加入10 μl CCK-8 溶液。将培养板在培养箱内孵育4 h，同时设置空白组，用酶标仪测定各组在450 nm 处的OD 值，每组设定3 个复孔，细胞活性=[（实验组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）]×100%。

1.3.5 GS-Rg1 诱导人MSCs 体外血管生成实验 基质胶4℃过夜溶解，移液枪枪头盒、EP 管、96 孔板均4℃过夜预冷；第2 天于冰盒上铺胶，50 μl/孔加入96 孔板，37℃孵箱放置30 min；当人脐血MSCs 增殖至培养皿底部的80%～90%时，使用胰酶消化并重悬，每孔加入1 ml 重悬液，细胞密度达到1×105个/孔；实验组用最佳浓度GS-Rg1 加入基质胶，对照组用等体积磷酸盐缓冲液处理；37℃孵育，培养24 h 后，倒置显微镜下观察并拍照3 张，选取最典型的图片展示，采用Image J 分析内皮细胞形成的管腔长度，管腔长度=主干长度+分支长度，成管长度取3 次平均值。

1.3.6 内皮分化指标CD31、vWF 测定 将载玻片放入培养板里，然后将2 ml 含有1×106个/ml 第4 代人脐血MSCs 悬液滴加在玻片上，加入最佳浓度GSRg1，48 h 后取出载玻片；放入-20℃冷丙酮中固定30 min，用磷酸盐缓冲液冲洗3 次，2 min/次；滴加3%过氧化氢溶液室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液冲洗3 次，2 min/次，0.5%Triton X-100 室温通透20 min；磷酸盐缓冲液浸洗3 次，3 min/次，吸干缓冲液，再滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；吸掉封闭液，每孔分别滴加CD31 及vWF 一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；磷酸盐吐温缓冲液浸洗细胞3 次，3 min/次，吸取一抗，再滴加稀释后的荧光二抗，湿盒中孵育1 h，磷酸盐吐温缓冲液浸洗3 次；滴加DAPI 避光孵育5 min，对标本进行染核，洗去DAPI；吸干液体，荧光显微镜下观察采集图像，使用Image-Pro Plus6.0 软件进行定量分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养结果

显微镜下可见细胞形态均一，呈长梭形的成纤维细胞样形态，是MSCs 的典型形态。见图1。

图1 光学显微镜下第3 代人脐血间充质干细胞（200×）

2.2 第4 代细胞诱导分化鉴定结果

成骨、成软骨和成脂诱导分化鉴定染色结果均可见大量深染色部分，显示其为MSCs。见图2。

图2 人脐血间充质干细胞成骨、成软骨和成脂分化鉴定结果（400×）

2.3 不同浓度GS-Rg1 作用下人脐血MSCs 增殖能力比较

GS-Rg1 浓度为40、80 mg/L 时，人脐血MSCs OD值高于其浓度为0、5、10、20 mg/L 时，差异有统计学意义（P ＜0.05）。GS-Rg1 浓度为80 mg/L 时，人脐血MSCs OD 值与其浓度为40 mg/L 时比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图3。

图3 不同浓度GS-Rg1 作用下人脐血间充质干细胞增殖能力比较

2.4 两组细胞活性比较

实验组细胞活性为（97.36±0.72）%，对照组细胞活性为（83.61±3.14）%，实验组高于对照组，差异有统计学意义（t=13.75，P ＜0.05）。

2.5 两组体外成管情况

实验组可见网状结构形成，对照组则多为细胞分散存在，见图4。实验组管腔长度长于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图5。

图4 两组体外成管情况

2.6 两组CD31、vWF 荧光强度比较

实验组CD31、vWF 荧光强度强于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图6。

图6 两组CD31、vWF 荧光强度比较

3 讨论

GS-Rg1 是人参的重要活性组分之一，其生理活性作用极为广泛，而在细胞层面上，具有上述类似功能的MSCs 为进一步研究其相关机制开辟了新途径。目前已有研究表明，GS-Rg1 可促进人或动物组织来源的MSCs 增殖[10-11]、血管新生[12]，并能诱导MSCs 在不同环境中定向分化成各种体细胞。目前研究表明，GS-Rg1 可诱导MSCs 表达神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白及神经生长因子，促进MSCs 增殖及向神经细胞分化[13]。Yin 等[14]研究发现，10 μmol/L的GS-Rg1 溶液可促进人牙周膜源MSCs 增殖，上调MSCs 碱性磷酸酶、骨桥蛋白和骨钙素等因子的表达，最终促进人牙周膜源MSCs 的成骨分化。Xu 等[15]发现，GS-Rg1 可提高第3 代人乳腺脂肪源MSCs 增殖能力，且能促进其向软骨细胞分化。GS-Rg1 可通过上调Ⅱ型胶原、酸性磷酸酶及弹性蛋白mRNA 水平来促进人乳腺脂肪源MSCs 向软骨细胞分化。由此可知，在一定条件下GS-Rg1 可诱导不同来源MSCs 向神经细胞、骨细胞及软骨细胞等定向分化。

MSCs 已经被证明在细胞实验和动物实验及临床中有促进血管生成的作用。MSCs 血管生成特性可归因于直接分化为内皮细胞[16]和旁分泌效应[17]。目前MSCs 主要的诱导分化方法包括外源性生长因子诱导MSCs 分化、基因修饰诱导MSCs 分化、将MSCs 与其他细胞共培养的方式诱导MSCs 分化等[18-19]。目前体外研究MSCs 向血管内皮细胞分化常使用的诱导因子有血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子等。其中血管内皮生长因子是血管内皮中最具特异性的分泌性生长因子，是正常血管形成和血管新生的必需调控因子[20-21]。此外，目前有多种中药活性成分及复方能诱导MSCs 向内皮细胞分化。周细胞是血管内壁的重要构件之一，能调节内皮细胞的功能，支撑血管的管腔结构。黄芪甲苷可激活TGF/Smad2 途径介导MSCs 分化为周细胞[22]。黄芪甲苷、丹参酮ⅡA 干预MSCs 后，能提高血管壁主要连接蛋白Cx37、Cx40 和Cx43 表达，促进MSCs 分化为内皮细胞[23]。由此可知，中药可以促进MSCs 定向分化成血管相关细胞。GS-Rg1 被证实能促进血管新生，但GS-Rg1能否通过诱导MSCs 实现定向成血管分化，目前鲜见相关研究。

种宗雷等[24]通过研究不同浓度GS-Rg1 干预人脐带MSCs 发现GS-Rg1 对其增殖有显著的促进作用，可减轻H2O2对人脐带MSCs 的损伤。但该研究设置的低、中、高3 个剂量组分别为0.5、4.0、32.0 μmol/L，研究结果提示GS-Rg1 的浓度与人脐带MSCs 的增殖呈正相关，而高剂量组32.0 μmol/L 不是促进人脐带MSCs 增殖的最佳浓度。本研究通过设置GS-Rg1 浓度梯度，研究其对人脐血MSCs 增殖功能的影响，发现GS-Rg1 促人脐血MSCs 增殖的最佳浓度为40 mg/L。进一步研究结果提示GS-Rg1 对人脐血MSCs 的细胞活性有促进作用，是具有制药前景的细胞活性药物。本研究结果提示，GS-Rg1 干预后人脐血MSCs 体外成管能力及表达内皮细胞特异性标志物CD31、vWF能力增强，为进一步探寻GS-Rg1 干预人脐血MSCs 后发挥促进血管新生的分子机制做铺垫，并为未来GSRg1 更好地应用于临床提供理论依据。然而，本研究未涉及分子通路和动物实验验证，GS-Rg1 促进MSCs发挥血管新生功能的具体机制亟待更深入的研究。