刘 佳，夏永军，熊智强，宋 馨，艾连中，王光强

（上海理工大学医疗器械与食品学院, 上海食品微生物工程技术研究中心, 上海 200093）

糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢疾病，由于老龄化、肥胖和生活方式的改变，糖尿病患者的数量在日益增加，据预测，2030年将有5.78亿人患有糖尿病，2045年这一数字将增加51%（7亿人）[1]。糖尿病患者的死亡人数和治疗费用也相当大，2017年全球共有500万糖尿病患者死亡，2017年全球糖尿病医疗支出估计为8500亿美元[2]。糖尿病成为当前世界各国共同面对的健康问题。糖尿病患者常伴有各种并发症，是造成糖尿病患者致死、致残的主要原因，主要包括视网膜病变、肾病、周围神经病变、足部溃疡以及自主神经病变等[3]。糖尿病主要分为3种类型：1型、2型和妊娠型糖尿病，其中2型糖尿病（Type 2 diabetesmellitus，T2DM）约占总数的90%[4]，所以T2DM的防治，是糖尿病预防和治疗的关键和重点。目前糖尿病患者主要依靠药物维持血糖的稳定，但是药物会伴随着较大的副作用，所以人们开始寻找“经济、天然、安全”的物质替代药物起到缓解糖尿病的作用。

经过长期的研究发现益生菌在缓解糖尿病方面有着显著的作用。益生菌是指当摄入一定数量时，对机体发挥有益作用的活性微生物[5]。益生菌可以通过调节肠道菌群、增强免疫力、降低胆固醇等，对高血脂、肥胖、糖尿病等慢性代谢疾病起到一定的改善作用。因此，本文以益生菌为研究对象，从体外快速筛选降糖菌株的方法，体内有效性的评价以及缓解2型糖尿病的机制三方面进行了梳理，以期为缓解糖尿病相关机制的研究提供理论依据及相关功能性食品的开发提供有效指导。

1 体外降糖益生菌的筛选

目前有关体外筛选具有降糖潜力益生菌的方法主要包括两个，分别为抑制α-葡萄糖苷酶的活性和抑制二肽基肽酶IV（Dipeptidyl peptidase IV，DPPIV）的活性。其中α-葡萄糖苷酶位于小肠刷状缘处，其参与碳水化合物分解，将多糖、寡糖分解为单糖，促进其吸收并进入血液[6]。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶活性来降低餐后血糖。α-葡萄糖苷酶抑制剂结构类似于寡糖，主要是通过竞争性的结合α-葡萄糖苷酶上的碳水化合物的结合位点，减少单糖的生成，降低血糖水平[7]。二肽基肽酶IV是一种丝氨酸蛋白酶，其作用底物包括胰高血糖素样肽（Glucagonlike peptide，GLP）-1和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（Glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP）[8]。目前DPP-IV抑制剂是一种缓解T2DM的有效药物，主要是通过保护GLP-1、GIP不被DPP-IV灭活，延长肠降血糖素激素的作用，从而维持血糖稳态，有效控制T2DM患者血糖水平[9]。

α-葡萄糖苷酶抑制剂和DPP-IV抑制剂都能有效的降低血糖，控制糖尿病的发展，目前已在临床上得到广泛应用，但是药物治疗常伴随着不良的反应和副作用，例如腹泻、腹胀和肝功能受损等。因此需要寻求安全可靠的方法以抑制α-葡萄糖苷酶活性和DPP-IV的活性。大量研究发现益生菌能有效的抑制这两种酶的活性，具有降血糖的潜力，从而起到缓解糖尿病的作用。Zeng等[10]从21株益生菌筛选得出植物乳杆菌ZF06-1，ZF06-3，IF2-14和短乳杆菌IF2-17具有较高的DPP-IV和α-葡萄糖苷酶抑制活性和益生菌特性，这也是首次表明乳酸杆菌能够抑制DPP-IV和α-葡萄糖苷酶的活性。陈佩等[11]测定了7株乳酸菌的α-葡萄糖苷酶的抑制能力、抗氧化能力及其基本的益生特性，并以鼠李糖乳杆菌（Lactocobacillus rhamnosus）GG 为阳性对照菌株，发现干酪乳杆菌CCFM0412具有较好的α-葡萄糖苷酶的抑制率（29.61%）及较高的抗氧化能力，具有潜在的降糖作用。闫芬芬等[12]以13株乳酸杆菌为研究对象，通过测定菌株细胞代谢物（Cell-free excretory supernatants，CFS）和细胞内容物（Cell-free extracts，CFE）对α-葡萄糖苷酶和DPP-IV活性的抑制率，来评定菌株的降糖作用，发现嗜酸乳杆菌KLDS1.1003的综合性能最佳：其对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达10.29%，对DPP-Ⅳ的抑制率为7.13%（CFS），50.14%（CFE），具有良好的降糖潜力和益生特性，有助于抗糖尿病益生菌的应用。

体外降糖益生菌的筛选具有操作简单方便、周期短和成本费用低的优点，但需进一步利用动物和临床实验进行验证。目前体外降糖益生菌的筛选主要是以α-葡萄糖苷酶和DPP-IV为靶点，期望探索更多的筛选靶点，更有利于糖尿病的防治。通过体外实验发现益生菌可能具有降糖的潜力，那么需要进一步通过体内实验来评价益生菌是否能起到降低血糖效果。

2 益生菌改善糖尿病作用的体内评价

糖尿病又被称为是无形的杀手，因为高血糖对人体有害，但是人体毫无感觉。所以血糖的评价是预防和治疗糖尿病的重要手段。其中T2DM的诊断包括以下3点：一天中任一时间血糖水平≥11.1 mmol·L-1（200 mg·dL-1）；空腹血糖（Fasting blood glucose，FBG）水平≥7.0 mmol·L-1（126 mg·dL-1）；口服葡萄糖 耐 量 实 验2 h血 糖 水 平≥11.1 mmol·L-1（200 mg·dL-1）[13]。并且有关报道指出空腹血糖和葡萄糖耐量实验（Oral Glucose Tolerance Test，OGTT）可用来评定胰岛素敏感性[14]。相关报道也显示糖尿病患者心脏衰竭的概率大于非糖尿病患者，并且血糖越高，心脏衰竭的概率越大[15]。新型冠状病毒（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）在糖尿病患者的死亡率高于非糖尿病患者，FBG＞7 mmol·L-1的死亡率高于FBG＜7 mmol·L-1[16]。可见血糖控制和改善葡萄糖耐量对于糖尿病患者的重要性。要研究益生菌对糖尿病的缓解作用，那么前提必须明确益生菌能否起到降血糖的作用。目前有许多研究表明益生菌能起到很好的降血糖的效果。Chen等[17]研究鼠李糖乳杆菌CCFM0528对T2DM小鼠的血糖耐受性的改善作用，经过12周的干预，相对于模型组，鼠李糖乳杆菌CCFM0528血糖降低近43%，葡萄糖曲线下的面积（Area under the curve of bloodglucose，AUC）达35%。Sabico等[18]以阿拉伯国家的T2DM患者为研究对象，8株益生菌组合干预6个月，空腹血糖从基 线11.7 mmol·L-1降 至7.2 mmol·L-1，下降了38.5%。Cardinali等[19]报道了对常规药物二甲双胍治疗无效的两例T2DM患者，纳豆枯草芽孢杆菌DG101干预4个月后，两例患者的血糖都恢复正常水平（95 mg/dL）。同时也有比如干酪乳杆菌K11[20]，副干酪乳杆菌NL41[21]，动物双歧杆菌01[22]，副干酪乳酸杆菌副干酪亚种NTU101[23]等也能在不同程度上降低血糖，起到缓解T2DM的作用。这说明来源不同的益生菌即使在不同的条件下，也能在一定程度上降低血糖，改善葡萄糖耐量，缓解T2DM的相关症状，所以有必要探讨一下益生菌缓解T2DM的机制。

3 益生菌缓解糖尿病的机制

体内评价确定了益生菌确实会对2型糖尿病患者的血糖、餐后血糖、葡萄糖耐有一定的改善作用，那么有必要从分子的角度出发，更深入总结概括益生菌对2型糖尿病的作用机制。许多研究表明益生菌在一定程度能对T2DM起缓解作用，主要机制包括改善肠道菌群，调整免疫炎症反应，改善肠道屏障功能，减少氧化应激，增加短链脂肪酸的分泌等。并且各个机制之间是相互关联共同缓解T2DM的发生和发展（表1）。

表1 不同益生菌对T2DM的影响Table 1 Effect of different probiotics on type 2 diabetes mellitus

3.1 改善肠道菌群

肠道菌群与人类的健康息息相关，肠道菌群是由1014种细菌组成，是人类细胞总数的10倍以上，所有肠道微生物的基因组被称为“微生物组”，比人类核基因组大100多倍[29]。肠道菌群失调，肠道内环境紊乱，人体便开始出现各种不适，甚至引发疾病。有关研究报道，与非糖尿病患者相比，T2DM患者粪便中普氏杆菌的浓度明显低于正常组[30]。Larsen等[31]发现糖尿病组厚壁菌门和梭状芽孢杆菌的比例显著降低（P=0.03）。目前肠道菌群是治疗T2DM的靶点之一。益生菌可以在人体肠道定植，改善人体肠道菌群，调节代谢，维护肠道系统平衡。王艳明等[32]发现复合益生菌组显著降低厚壁菌门、放线菌门和大肠埃希菌属水平、增加拟杆菌门和双歧杆菌属水平，从而降低空腹血糖，改善葡萄糖耐受能力。张海平等[33]给T2DM大鼠喂食碧悠益生菌发酵乳，与模型组对比，发现大鼠粪便中的大肠杆菌数量显著降低且嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌和柔嫩梭菌的数量均显著升高，空腹血糖显著低于模型组。以上结果表明T2DM患者的肠道微生物的动态平衡被破坏，补充益生菌能改善肠道菌群结构，抑制有害菌繁殖，对T2DM的形成和发展有一定的预防作用。

3.2 调节免疫反应

正常情况下，肠道菌群处于动态平衡中，但是当肠道菌群失调时，革兰氏阳性细菌减少，革兰氏阴性细菌增多，会导致内毒素（Lipopolysaccharide，LPS）分泌增多，可能引发内毒素血症，导致胰岛β细胞破坏或凋亡[34]；同时炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor，TNF-α）、白 介 素（Interleukin，IL）-6的释放增加以及抗炎细胞因子IL-10的减少，引发全身一系列的非特异性炎症反应，干扰胰岛信号传导，引发胰岛素抵抗，从而引发T2DM的发生[35]。卢彩霞[36]研究显示与健康对照组相比，T2DM患者体内IL-6，TNF-α和IL-1β显著升高，导致患者免疫功能衰弱，加重病情的发展。有报道显示益生菌可以通过调节机体免疫功能，促进抗炎因子的分泌和减少促炎因子的分泌，从而预防和控制T2DM的发生。Lim等[25]研究表明小鼠口服乳酸杆菌sakei OK67，可以通过减少促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达改善HFD诱导的高血糖。Chen等[17]研究显示，鼠李糖乳杆菌CCFM0528增加血清中抗炎因子IL-4和IL-10的表达，减少TNF-α、IL-6和IL-8的表达，进一步在脾脏中测定了这些炎症因子的表达情况，更好的证实鼠李糖乳杆菌CCFM0528对糖尿病的保护作用是通过调节宿主免疫反应来实现的。

3.3 减少氧化应激反应

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内的氧化和抗氧化系统失衡，大量的自由基产生并聚合，导致组织损伤，引发各种疾病[37]。氧化应激和糖尿病及糖尿病的并发症关系密切，主要通过损伤胰岛β细胞，降低组织对胰岛素的敏感性，引起血糖升高，导致糖尿病的发生和发展。付建芳等[38]研究表明相对于健康对照组，T2DM患者空腹和餐后2 h的SOD水平显著降低，MDA水平显著增加。而报道显示抗氧化剂可以通过清除自由基中间产物终止链式反应，并通过中和自由基来抑制其他氧化反应[39]，逆转氧化应激对机体造成的损害，缓解糖尿病及其并发症的发展。益生菌被认为是一种新兴的有效抗氧化剂来源，Zheng等[40]报道摄入益生菌和合生元可显著增加糖尿病患者的血清抗氧化指标如：总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，TAC）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH），并降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的表达。Zhang等[22]表明动物双歧杆菌01可显著恢复糖尿病大鼠肝脏超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过 氧 化 氢 酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）和GSH活性，降低MDA水平，同时增加Nrf2的表达，减少Keap1的表达，起到抗糖尿病的作用。Zhu等[21]研究发现与T2DM大鼠相比，喂养副干酪乳杆菌NL41能显著性的增加肝脏中GSH、CAT、SOD的水平，降低MDA的含量，使血糖恢复至正常水平，保护了胰岛β细胞的功能进而缓解T2DM的发展。

3.4 增加短链脂肪酸的含量

短链脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）是肠道微生物发酵膳食纤维的主要产物，主要有乙酸、丙酸和丁酸，在宿主内发挥着相应的作用[41]。研究表明，SCFAs在调节宿主代谢中起着关键作用，SCFAs主要通过G蛋白质偶联受体（G protein-coupled receptor，GPR）43和41发挥生物效应[42]。SCFAs和GPRs的结合将刺激下游肠道激素GLP-1和胃肠多肽酪酪肽（Peptide y y，PYY）的分泌[43]，这两种激素都能起到降低血糖的作用，从而缓解糖尿病的发生。潘虹等[44]研究发现高脂膳食大鼠的血糖显著升高，粪便短链脂肪酸水平显著降低，加速了2型糖尿病的发病进程。朱晓振等[45]研究表明灌胃丙酸钠可以显著降低T2DM小鼠的血糖水平和胰岛素抵抗。可见短链脂肪酸和2型糖尿病的发展密切相关，而补充益生菌会增加短链脂肪酸的含量，起到降低血糖水平的作用。Li等[24]研究发现乳酸菌G15和Q14显著增加了SCFAs细菌的产生（柔嫩梭菌和普氏拟杆菌），并且上调了乙酸盐和丁酸盐的浓度，同时结肠中GPR43 mRNA表达增加了1.5倍，激素GLP-1和PYY的浓度也显著增加（P＜0.05），起到修复2型糖尿病小鼠葡萄糖不耐受的作用。许女等[46]报道植物乳杆菌173可以促进SCFAs的产生，并且可以显著提高大鼠肠道中GPR43和 GPR41基因的表达量，显著改善了大鼠血糖、血脂和激素水平。白璐等[20]将干酪乳杆菌K11饲喂高脂饮食和STZ诱导的2型糖尿病小鼠，结果表明，与模型组大鼠相比，干酪乳杆菌K11治疗显著提升了乙酸、丙酸和丁酸的含量水平（69.61%、16.07%和52.69%），并且显著增加了GLP-1的分泌，降低了T2DM小鼠的血糖。

3.5 调节肠道屏障

肠道屏障是机体防御功能的一道重要防线，肠道屏障功能主要是由肠黏膜屏障来实现的，肠粘膜屏障最为重要的是机械屏障，正常情况下能有效阻止细菌及LPS等有害物质透过肠粘膜进入血液，维持机体内环境的稳定[47]。当肠道屏障功能损坏，肠黏膜屏障受损，肠道通透性增加，细菌内毒素进入血液，诱发炎症和胰岛素抵抗是导致2型糖尿病发生的重要原因[48]。Horton等[49]首次证明T2DM患者肠道通透性的变化，结果显示T2DM患者肠道通透性显著增加，并与炎症因子TNF-α和IL-6水平的增加相关。因此，保护肠上皮紧密连接、维护黏膜屏障在糖尿病的防治中有着重要意义。Hung等[23]用副干酪乳杆菌亚种NTU101喂养高脂高果糖诱导的2型糖尿病大鼠，结果表明，9周副干酪乳杆菌亚种NTU101的治疗可恢复结肠中紧密连接蛋白Occludin mRNA、肝脏GLUT2 mRNA和脂肪组织GLUT4 mRNA的表达，增加血清中LPS的分泌，明显降低了大鼠的空腹血糖。许女等[46]研究表明给高脂饮食及注射STZ诱导的2型糖尿病大鼠喂食植物乳杆菌173，可以显著上调肠道紧密连结蛋白ZO-1、Claudin、Occludin及黏蛋白MUC2 基因的表达，增强肠道黏膜屏障功能，从而起到降低血糖作用。

4 结语

本文阐述了体外具有降糖潜力益生菌的筛选方法，体内评价益生菌的降糖效果和降糖机制，更好的为探索开发具有缓解甚至治疗糖尿病的益生菌提供方向。但是糖尿病机制复杂多样，个体之间存在着特异性，加之不同益生菌的作用机制及其效果也有所不同。因此，未来应在综合考虑以上各因素的基础上探寻更多的降糖靶点，做到“对症下药”来更好的缓解糖尿病。同时还可以考虑复合益生菌产品的开发，通过不同菌株之间的协同作用更好的起到缓解糖尿病的作用。此外，目前体外筛选降糖菌株的方法比较单一，可以与更多的体内降糖靶点相结合，在体外寻找更多筛选降糖菌株的方法，为具有缓解糖尿病作用的益生菌产品的研发奠定一定的基础。