高雅鑫，张蒙冉，侯丽真，高 洁，王凤忠, ，李淑英,

（1.中国农业科学院农产品加工研究所, 北京 100193；2.塔里木大学生命科学学院, 新疆阿拉尔 843300）

心血管疾病一直是世界上发病率和死亡率最高的慢性疾病，该趋势持续增长并趋于年轻化[1]。《中国心血管与健康疾病报告（2019）》显示，我国现有心血管疾病患病人数为3.3亿，每5例死亡病例中就有2例由心血管疾病引起，占比高达40%[2]，其中血栓是引起心血管疾病人群死亡和致残的首要原因[3]。目前治疗血栓性心血管疾病的临床药物多以尿激酶、阿替普酶、瑞替普酶等纤溶酶原激活剂为主，但这类药物需静脉注射，存在半衰期短、毒副作用大、价格昂贵等缺点，不易成为大众可普遍消费的药品[4]。

纳豆（Natto）是由经枯草芽孢杆菌发酵蒸煮过的大豆制成的一种功能性食品，因富含纳豆激酶而具有防治心血管疾病的功效[5-6]。纳豆激酶具有多效溶栓功效，主要表现为可以直接溶解血栓，也可以激活机体的血栓溶解系统并抑制机体的凝血系统[7]。与临床药物相比，具有可口服、半衰期长、生产成本低廉、无毒副作用等优点[8-9]。因此，纳豆制品在日本一直被作为有效预防心血管疾病的最佳食品而备受推崇。日本国立癌症中心研究结果表明常吃纳豆的人群癌症死亡率比不常吃的人群降低了10%[10]。世界卫生组织公布的数据显示，我国心血管疾病的发病率是日本的75倍。中国人的饮食追求色香味俱全，因而，独具“氨臭味”的纳豆一直未能在中国消费市场普及。

基于纳豆在心血管疾病防治方面的优点，领域内专家也一直致力于从事相关研究，但工作重心还是侧重于挖掘优势菌种，提高纳豆激酶的活性和稳定性。同时结合中国人的饮食需求，也陆续开展了部分纳豆风味改良方面的工作。近年来随着检测分析技术的进步，领域内专家针对纳豆的不良风味开展了物质鉴定工作，以期从根本上改良纳豆风味，开发符合中国人口味且富含纳豆激酶的产品。基于此，本论文就纳豆特有不良风味“改良”和“物质鉴定”两方面的研究进展进行综述，为纳豆在我国的市场推广奠定理论基础。

1 纳豆风味改良

为提高纳豆在中国的接受度，改良其风味具有重要的研究意义。针对不良风味的产生，研究者的主要关注点在优化和改变发酵菌种、控制工艺和添加调味料三个方面，以弥补纳豆风味的不足。

1.1 菌种的选择

1.1.1 筛选优良菌株 纳豆的不良风味是在枯草芽孢杆菌发酵大豆过程中形成的，菌株之间的个体化差异会引起不良风味物质含量的不同，因而筛选一株优良的枯草芽孢杆菌是解决不良风味的重要举措。刘彦敏等[11]从豆酱、豆豉等我国传统发酵大豆制品中筛选得到多株枯草芽孢杆菌，均具有发酵大豆制作纳豆和产纳豆激酶的能力，同时获得了多种品质风味俱佳的本地化纳豆。TAKEMURA等[12]敲除了与支链短脂肪酸（Branched-chain short fatty acids，BCFAs）合成相关的基因，筛选培育风味优良的枯草芽孢杆菌，缓减了纳豆的不良风味。

1.1.2 添加风味菌株 在枯草芽孢杆菌的基础上，通过与其他菌株进行混菌发酵改良风味，如乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等产酸菌及毛霉、酵母等真菌[13-15]，其产生的酶类作用于纳豆中的不良风味物质，综合提升纳豆的风味品质。JHAN等[16]通过枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌的共培养，所得产品不仅风味良好，还含有抗氧化因子和大量潜在的益生菌。何人可等[17]采用嗜热链球菌对纳豆进行二次发酵，并优化了二次发酵工艺，使得纳豆不良风味下降。高泽鑫等[15]以发芽的黄豆为原料，将毛霉扩大培养后，再与枯草芽孢杆菌按照一定菌种比混合发酵，得到的豆豉产品不良风味明显减少。也有研究通过添加酿酒酵母使纳豆不良风味降低的同时，还产生淡淡的醇香[18]。可见添加风味菌株的混合发酵可以有效提高纳豆的感官品质，改善纳豆的不良风味。

1.2 工艺的控制

1.2.1 调整原料碳氮比 发酵原料中含氮量是影响纳豆风味的决定因素，所以有学者尝试通过改变豆类品种或添加外来碳源的方式来改良纳豆的风味[19]。有研究表明蚕豆中淀粉含量较高，不需要添加碳源，便能实现高效发酵，其口感和风味均得到了改善[20]，故而，蚕豆、芸豆、红豆、鹰嘴豆等豆类逐渐被开发为新型纳豆[20-21]。张杰等[22]将糯米和小黄豆按2:8的比例混合发酵，有效减少了游离氨的过度产生，改良了纳豆风味。董岳峰等[23]选择薏米与大豆搭配发酵薏米纳豆，薏米糖质含量比大豆高，调整了含氮比例，降低了游离氨的同时也改善了产品口感。因此，采用不同品种的豆类或添加其它富含碳水化合物的杂粮，可实现高效发酵，同时改善其原有风味和口感。

1.2.2 优化发酵条件 纳豆的营养品质和感官风味与发酵工艺直接相关，在不同工艺条件下可产生极为不同的质地与风味。工艺优化多从大豆前处理、发酵和后熟三个阶段展开研究，涉及到的工艺环节包括原料浸泡时间、料液比、蒸煮方式及温度和时间、接菌温度、接菌量、发酵及后熟时间、储存温度和时间等[19,24]。关茵等[25]对原料浸泡的料液比、蒸煮温度、接菌量及发酵时间等进行了优化，以氨气味为衡量指标，获得了不良风味最少的发酵工艺。也有研究通过增加大豆含水量为60%，调整大豆厚度为3 cm等条件，降低了纳豆中游离氨的产生[26]。通过优化上述条件，使菌种保持最佳的生长状态，调控微生物与大豆的互作过程，进而影响不良风味物质的形成，以制作风味及纳豆激酶等营养功能指标均良好的纳豆。

1.3 调味品的添加

1.3.1 鲜食纳豆的调味 为了满足消费者对口感风味以及营养健康的双重需求，现有纳豆主要是通过添加调味剂和香料等缓和其不良风味。主要有两种添加辅料的方式：一种是在发酵过程中加入不同的调味料，如用花椒、十三香、咖喱粉等调料水浸泡大豆，或者在后熟阶段加入食盐、辣椒、茴香等调料，不仅有效掩盖了纳豆的不良风味，也赋予了其易被消费者接受的独特风味[27]；一种是以新鲜纳豆为基础，附带粉包或酱包一起销售，涉及调味品（芥末、咖喱、孜然等）、调味酱（芝麻酱、糖豆酱、辣椒酱等）以及果酱（芒果、蓝莓、草莓等），食用时搅拌均匀即可[26,28]，按自己喜好调制口味各异的风味鲜食纳豆。

1.3.2 鲜食纳豆的深加工 随着冷藏时间的延长，鲜食纳豆的活菌数及部分生物活性物质均有所降低，口感和风味也会逐渐下降，有研究证明冷藏3 d是其最佳食用时间[29]，冷藏时间较短，严重影响了产品的接受度和市场的销售。因此，衍生出经过干燥、粉碎深加工后制得的纳豆系列产品，以纳豆烘干粉和纳豆冻干粉为主，既能避免其在冷藏过程中由于菌株代谢出现不良风味加重的现象，又能延长保质期[30]，纳豆粉可以用合适温度的热水直接冲调饮用[31]；也可以结合胶囊和压片工艺，复配木糖醇、甘露醇、奶粉等多种辅料，开发不同系列的纳豆胶囊和纳豆糖果、奶片等咀嚼片[32-33]；又或者研制成中国人喜爱的糕点，搭配绿茶粉、木糖醇、海藻糖、食用油，加工成茶香纳豆糕[34]，更贴合中国消费者的饮食习惯和口味偏好。

2 纳豆不良风味物质鉴定

虽然大豆原料自身带有豆腥味，包括1-辛烯-3-醇、己醛、2-戊基呋喃等化合物[35-36]，但是发酵可以有效降低豆制品的豆腥味，赋予其新的感官风味[37]。因此，纳豆不良风味源于微生物与大豆的互作，并有学者证明在蛋白酶的作用下，蛋白质会降解为小肽和氨基酸，但氨基酸会进一步降解产生不良风味物质[38]。不断有研究分析并鉴定纳豆中不良风味物质，主要是异丁酸甲酯、氨、2-甲基丁酸、吡嗪等挥发性化合物[39-40]。近年来，LIU等[41]研究表明 2,5-二甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪，2,3,5,6-四甲基吡嗪和2,3,5-甲基-6-乙基吡嗪对纳豆风味有很大贡献。KEITAROU等[42]研究证明异戊酸、三甲基吡嗪对枯草芽孢杆菌发酵食品的风味有很大贡献。HONG等[43]认为在纳豆发酵过程中，合成的异丁酸和异戊酸引起了纳豆中难闻的气味。因此，纳豆中不良风味物质主要归类为游离氨、吡嗪和BCFAs，这些物质均与氨基酸代谢有关，例如，谷氨酸和精氨酸等涉及游离氨的释放[44]，丝氨酸和苏氨酸等涉及吡嗪的形成[45]，亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸是支链醛和BCFAs的前体化合物[46]。

2.1 游离氨

游离氨是一种有刺激性臭味的气体，类似于臭鸡蛋和蔬菜腐败的味道，也是纳豆中公认的不良风味。枯草芽孢杆菌代谢产游离氨的主要途径是联合脱氨基作用和转氨作用，而非脱羧作用[47]。已有学者证实，枯草芽孢杆菌的产游离氨代谢至少与5种氨基酸有关[48]：在蛋白酶的作用下，精氨酸分解转化为鸟氨酸，同时生成尿素，再经尿素酶降解产游离氨；同样，天冬酰胺由酶催化产生天冬氨酸并释放游离氨，在天冬氨酸酶催化下继续产生延胡索酸和游离氨。然而，枯草芽孢杆菌产氨主要是通过谷氨酸代谢，谷氨酸脱氢酶（GDH）是整个代谢的关键酶，在该菌株内，GDH由rocG基因和gudB基因编码，致力于谷氨酸的降解，同时产生游离氨，不参与谷氨酸的合成[49]，并且在氮源丰富的发酵基质下，编码GDH的rocG基因很活跃[50]，因此，游离氨确为引起纳豆不良风味的物质，也印证了“发酵原料中含氮量的差异和菌种之间的个体差异会产生不同程度氨臭味的纳豆产品”的事实。

2.2 吡嗪类化合物

吡嗪是传统发酵食品风味的重要贡献者，可以促进食品的整体香气，如中国白酒，及以大豆和可可豆为基础的发酵食品，主要为2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪[51]。GC-O嗅闻分析中对2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的风味整体描述为“焙烤味、坚果味、霉味和泥土味”[52]，该类化合物阈值较低，在其含量较低的情况下就能呈现优良风味，含量过高可能会呈现“霉味、泥土味”等不良风味[53]，因而，极可能由于2,5-二甲基吡嗪在纳豆中合成量过多，远远超过其阈值而引起纳豆制品产生不愉快气味。CHRISTIAN等[45]已明确枯草芽孢杆菌中2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的主要合成途径，主要涉及苏氨酸的合成与降解（图1）。天冬氨酸代谢合成苏氨酸，经L-苏氨酸-3-脱氢酶（TDH）催化产生氨基丙酮，通过氧化、环化等非酶促反应生成2,5-二甲基吡嗪，而氨基丙酮还可以代谢生成丙酮酸，通过缩合生成α-乙酰乳酸，再脱羧产生乙偶姻，进而被分泌到胞外，和游离氨发生非酶促反应，生成四甲基吡嗪[54]。整个发酵体系在不添加任何前体物质（苏氨酸、乙酰丙酮）的前提下，主要存在2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，几乎没有四甲基吡嗪，2,3,5-三甲基吡嗪的合成机制与2,5-二甲基吡嗪类似[55]；此外，氧气的有效利用，会引起吡嗪类化合物的过量合成[34]，枯草芽孢杆菌是一种好氧菌，发酵体系内氧气充足的时候代谢加速，可能引起了纳豆中吡嗪类化合物大量聚集，进而使纳豆产生风味劣变。

图1 2,5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪合成的代谢途径Fig.1 Metabolic pathways for the synthesis of 2,5-dimethylpyrazine and tetramethylpyrazine

2.3 支链短脂肪酸

支链短脂肪酸（BCFAs）一般是碳原子数小于6的有机脂肪酸，主要包括异丁酸、异戊酸、异己酸、2-甲基丁酸等。GC-O嗅闻分析中对异戊酸等BCFAs的风味描述为“银杏果臭味、酸味、刺激的酸败味”[56]，佐证了BCFAs与纳豆的不良风味有关。BCFAs主要通过支链氨基酸的分解代谢产生，即亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，该代谢通路涉及的合成基因和关键酶在不同种属微生物中差异较大。在枯草芽孢杆菌内，β-酮酰基-酰基载体蛋白合酶III（FabH）是合成BCFAs的关键酶[57]，此外，支链α-酮脱氢酶复合物（BCKDC）也被证实为BCFAs合成代谢途径的一种关键限速酶[58]。但在不同的枯草芽孢杆菌中其合成的关键基因和表达差异极为显著，因此支链氨基酸对不良风味的贡献与菌株本身有一定的相关性。

3 应用与展望

目前预防和治疗心血管疾病的纳豆产品越来越受到关注，但由于其特有的不良风味，仍然不能被我国人群广泛接受。因此，采用合适的风味改良方式暂时缓解纳豆风味问题，如改变发酵菌种、优化工艺等，以初步满足中国人食用纳豆的基本需求，是纳豆进入我国市场的重要举措。但是，从根本上明确纳豆不良风味的物质基础及其产生途径，是有效控制和消除纳豆不良风味的根本所在。随着多组学分析技术及遗传操作手段的发展，使得解决上述问题并通过靶向控制发酵过程中不良风味物质合成相关基因的表达和调控成为可能。可见，纳豆产品中风味的定向改良具有很好的发展前景。