黄郑炜, 钟子乔， 陈智伟， 谢雨珂， 王文浩

(1. 暨南大学 药学院, 广东 广州 510632; 2. 中山大学 药学院, 广东 广州 510006)

近十年来，纳米药物(nanomedicines，NMs)发展迅猛，医药界逐渐将NMs应用于不同的给药途径.在肺部给药方面，吸入NMs具有应用于包括哮喘、肺部感染和肺癌等肺部疾病的临床治疗前景[1].相比于全身化学疗法及应用传统药物的吸入疗法而言，吸入NMs既可通过呼吸道将治疗药物局部地输送到肺患病组织，避免首过消除，减少全身性不良反应(如肝毒性[2])，又可控制药物的释放速度，达到缓释的治疗效果，减少给药的频率[3]，还可通过修饰NMs的表面基团使NMs获得主动靶向性，从而实现被靶细胞特异性摄取[4]，优势显著.

报道常见的用于肺部治疗的NMs有聚合物胶束、脂质体、金属纳米粒、高分子囊泡和树枝状大分子等，通过物理包埋或化学结合的方式递送药物.除此之外，还有聚合物-药物缀合物，通过化学键共价结合作用来实现载体与药物的偶联.其中，脂质体、纳米胶束和高分子囊泡生物相容性较好[5]且载药能力较强[6]，研究最为广泛.

虽然NMs优势显著，但是临床应用中NMs很可能受到肺表面活性剂(pulmonary surfactant，PS)的影响.PS会吸附到NMs的表面(图 1)，从而形成生物分子层，影响NMs的生物化学特性[7]，

图1 NMs吸附PS中的脂类和蛋白质等

使NMs的药动学和药效学行为改变.本文就PS的组成和特性、PS与NMs的相互作用对PS和NMs的影响及它们相互作用的表征方法等进行综述，为吸入NMs的临床应用提供参考.

1 肺表面活性剂

PS是由10%蛋白类和90%脂类组成的一种复杂磷脂蛋白混合物，最初在肺泡腔内的液体层中发现，后来发现其系由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成并分泌.PS的主要成分为表面活性物质结合蛋白(surfactant-associated protein，SP)、二棕榈酰卵磷脂(dipalmitoyl phosphatidylcholine)和其他脂类.SP约占PS的10%，包括表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白B(SP-B)、表面活性蛋C(SP-C)、表面活性蛋白D(SP-D)、表面活性蛋白G(SP-G)和表面活性蛋白H(SP-H).这6种SP在肺组织发挥生理功能中起着非常重要的作用[8].SP-A与SP-D为大分子亲水性SP，主要发挥防御功能，参与呼吸道免疫调节.SP-A及SP-D通过聚集、调理素和促凋亡作用，及调控炎症反应与活化吞噬细胞等生理机制，识别和消灭病原体[9].SP-B与SP-C是小分子疏水性SP，主要发挥调节表面张力，防止呼气末肺泡萎缩的作用[10].SP-G和SP-H是近几年来发现的新的肺表面活性物质结合蛋白[11]，其兼有SP-A、SP-D和SP-B、SP-C的功能[12].二棕榈酰卵磷脂约占PS的41%，是含量最多的组分[11].

2 肺表面活性剂与吸入纳米药物的相互作用

NMs被吸入进肺深部遇到的一个重要的生物屏障就是PS,PS的多种成分会被吸附到NMs表面.当NMs与PS接触时，基于NMs的理化特性，将诱导不同的PS成分参与到相互作用中.这可能会干扰粒子的预期药理作用，且会影响到PS的正常功能，从而改变NMs的生物相容性或毒性[13].

PS中的蛋白质和脂质等与NMs形成络合物，遵循由Vroman效应定义的吸附和解吸附动力学.这一动力学是与时间相关的过程，其中，丰度高亲和力低的分子首先被吸附，然后被丰度较低亲和力较高的分子替代[14-15].除了上述过程之外，高离子强度和PS内的蛋白质(主要是SP)吸附都会破坏NMs表面的稳定性，导致NMs聚集体的形成.这种现象是否发生，既取决于蛋白质的浓度，也取决于NMs的理化性质[16].Ruge等[17]利用动态光散射和透射电子显微镜(transmission electron microscope)来研究SP-A与甘露糖化NMs的相互作用.这项研究表明SP-A与甘露糖化NMs结合形成了较强的聚集态，且SP-A可增加巨噬细胞对NMs的摄取.NMs聚集体的形成直接影响细胞摄取率.与单个NMs相比，A549细胞对聚集的金纳米粒子摄取减少了25%[18].

总而言之，NMs表面吸附有PS时，NMs的各种性质，包括其稳定性、疏水性、表面电荷、细胞摄取率和穿透能力等，都会发生很大的改变；同时，PS与NMs接触后，PS的活性和压缩性等生理功能也会受到影响.因此，深入了解PS与NMs的相互作用，减少或利用PS对NMs诸如表面吸附、细胞摄取率、疏水性和表面电荷等方面的影响，减弱NMs对PS生理功能的干扰，对推动NMs的实际临床应用是非常重要的.

2.1 NMs与PS相互作用的分类

NMs与PS的相互作用是多种因素共同参与的结果(图2).根据其中起主导作用的因素进行分类，大致可分为疏水作用、静电相互作用[19]、氢键和范德华力[20]等.

图2 NMs与PS相互作用示意图

2.2 相互作用对吸入纳米药物的影响

2.2.1 对NMs疏水性和表面电荷等的影响

与血浆等其他生物流体相比，PS的脂质含量占比大得多，这导致了NMs吸附的活性物质成分在肺部区域中与其他解剖环境中明显不同[21].这种表面吸附物质的结构取决于NMs的关键理化性质，如NMs的组成成分、亲疏水性和表面电荷[19].已有研究证明氧化硅或氧化锆吸入纳米药物并不直接与不含蛋白质的纯脂样品相互作用，推测NMs-PS脂质相互作用可能是由蛋白质介导的[22].一些蛋白质被吸附到NMs表面，如SP-D或抗菌肽，会触发脂质的吸附[21-23].蛋白质的吸附会随着NMs的浓度和表面积的增加而增加[23].

NMs的疏水性和表面电荷等理化性质在调节粒子在PS层上的转运中起着重要的作用.Hu等[19]首次通过实验证明了不同疏水性的NMs对一种外源天然PS生物物理性质的影响，同时利用分子动力学模拟研究PS单分子膜与不同理化性质的NMs之间的相互作用机理.NMs的疏水性决定了它们在天然PS膜上的位移程度.亲水性NMs快速穿透PS单层，而部分疏水性NMs被PS单层捕获.而NMs的表面电荷在影响NMs跨PS单层的位移中只起次要作用.Hu等[19]还发现阴离子NMs选择性地吸附SP-B，但不吸附SP-C.因此，阴离子亲水性NMs可以诱导SP-B从PS单分子层中移出，但不能诱导SP-C移出.虽然阴离子疏水性NMs被PS膜捕获，但它也选择性将SP-B吸附到表面.这项研究的数据表明，静电和疏水相互作用之间的平衡是NMs移位和与PS单分子层相互作用的原因.此外，DPPC等脂质在柠檬酸稳定的银NMs上的吸附已被证明可以降低这些NMs由于pH的影响而聚集的趋势[24].

必须指出，在任何情况下，由于分子在其表面的吸附或在输送过程中环境条件的改变而引起的NMs的电荷或聚集状态的变化，都可能影响NMs的最终靶向部位[25].

2.2.2 对NMs细胞摄取率等的影响

进入肺深部是NMs被肺泡上皮细胞摄取的先决条件.而NMs表面吸附PS这一现象已经被证明在调控NMs转运过程里起着重要的作用：仅当吸附PS后，某些NMs才可被转运至肺深部.例如，Tomoko等[26]向大鼠气管内注射卵磷脂包覆和未包覆的聚苯乙烯微球，结果显示这两种微球都被肺泡巨噬细胞吸收，而只有卵磷脂包覆的微球可进入Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞(图3).

PS除了具有运送NMs进入肺深部的独特能力外，还具有促进肺泡细胞摄取NMs的能力.Yan等[27]使用一种具有代表性的雾化亲水性药物的模型纳米液滴，利用分子动力学模拟研究NMs与PS层的相互作用.为了让纳米液滴的表面疏水性更强，他们还设计了一种脂质包被的纳米液滴.此项研究结果表明，裸露的纳米液滴迅速黏附在PS层上，释放出扩散到PS层的药物.裸露的纳米液滴具有较高的表面张力，这一性质增强了其跨层扩散，但与此同时，纳米液滴破坏了PS层的超微结构.通过在纳米液滴上涂盖脂质，减少了纳米液滴对PS的扰动作用.而且脂质包裹的纳米液滴可以很容易地被PS层包裹形成泡状结构，这可能会促进与细胞膜的融合，从而促进药物向次级器官的释放.由此可知，PS吸附到NMs表面，或利用脂质修饰NMs，均可改变NMs的穿透能力和被细胞摄取的能力.

近年来，PS修饰的脂质体被提出以促进药物的吸收[28].De Backer等[29-30]观察到在体内和体外，包覆PS的比未包覆的葡聚糖纳米凝胶更有效地将siRNA输送到不同类型的细胞.PS组分以某种方式促进了NMs在细胞内移位到胞质中，在胞质里siRNA产生沉默.另外，提出SP-B蛋白可能是PS中影响siRNA传递效率的关键因素.近几年来，Merckx等[31]确定SP-B是上述纳米复合材料增强siRNA递送效率的关键成分，且首次将天然SP-B与改善小RNA疗法的细胞递送联系起来.利用小鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的急性肺损伤模型，在体内同样证明了SP-B促进转运的作用.

2.3 相互作用对肺表面活性剂的影响

NMs与PS的相互作用除对NMs产生显著影响之外，也会导致PS生理功能的改变.吸入NMs与活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生有关，而ROS的产生会直接导致Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞的损伤.肺泡上皮细胞的损伤和炎症会进一步影响PS的合成、组成、结构、代谢和功能等[32].

PS由脂质和多种蛋白组成，它们的协同作用在PS行使正常生理功能中起关键作用.因此，如果某些组分被移除或破坏，PS的生理功能可能会受到严重损害.而由于NMs理化性质的特点，它会选择性吸附PS的某些成分，导致PS成分的缺失[13].疏水性SP的缺失将导致PS表面活性的抑制.例如，当SP-B或SP-C被NMs吸附时，它们会从PS膜中除去，从而导致PS活性抑制.SP-B或SP-C含量降低到一定水平以下会导致PS在气液界面的吸附减少，从而限制其降低表面张力的能力以及其压缩性[31].亲水性SP也可能吸附于NMs表面，导致PS生理功能受损.例如，单壁碳纳米管在动物模型上可以吸附SP-A和SP-D[33].金属氧化物纳米颗粒倾向于吸附SP-A，金纳米颗粒倾向于吸附SP-D[24].这两种蛋白的完全或部分缺失也与肺先天免疫防御受损有关[34].

亲疏水性不同的NMs也会对PS产生不尽相同的影响.在Langmuir-Blodgett槽中进行的研究表明，疏水NMs能够与PS发生相互作用，聚集在脂质凝聚域周围，使其变得更小，从而使界面膜流态化[23].而利用亲水性聚合物NMs的研究证实，它们可以保留在PS单分子层中形成聚集体，干扰亚相物质的相变和再吸附，并增加膜的可压缩性[19, 23].尽管它们增加了压缩性，抑制了相变，增加了最小表面张力，但实际影响并不明显.

此外，不同尺寸的NMs会对PS产生不同程度的影响.Dwivedi等[35]考察了不同粒径的疏水NMs对PS薄膜的影响，观察到12 nm和20 nm的NMs对PS薄膜的影响不大.然而，在原子力显微镜(atomic force microscopy)下观察到，136 nm NMs增加了模型PS薄膜的压缩性，这是由于形成了多层凸起结构，阻碍了最小表面张力的获得，引发PS功能障碍.这项研究得出的结论是，136 nm NMs对PS产生的影响比12 nm NMs更为显著(图4).

图4 不同尺寸的NMs对模型PS薄膜的影响

本文所涉及的NMs与PS相互作用的研究及其相应体系如表1所示.

表1 NMs与PS相互作用Table 1 Summary of the interaction between PS and NMs

3 肺表面活性剂与吸入纳米药物相互作用的表征方法

一方面，NMs在被吸入后，部分NMs与PS之间的相互作用将导致NMs的性质变化.另一方面，此相互作用可能会影响PS系统的正常功能.因此，有必要研究NMs与PS的相互作用，以确定NMs的生物相容性，并帮助追踪这些NMs对肺部生理活动的影响.目前常用的NMs与PS相互作用的表征方法如图5.

图5 NMs与PS相互作用的表征方法

在对表面吸附有PS的NMs进行形态学研究时，一般会采用透射电子显微镜和原子力显微镜来进行表征.Hatami等[36]利用透射电子显微镜观察单宁酸-肺液复合体形成的聚合物形态状态，发现单宁酸-肺液配合物可自组装为球形颗粒，粒径<30 nm.

为了分离鉴别NMs与PS之间的相互作用后NMs表面所吸附的蛋白，通常会采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(polyacrylamide gelelectrophoresis)、体积排阻色谱法(size exclusion chromatography)、流体动力相互作用色谱法(hydrodynamic interaction chromatography)和液相色谱-质谱联用方法(liquid chromatograph-mass spectrometer)等[37-38].Tenzer等[39]用该方法鉴定出了硅纳米给药系统表面吸附了300余种不同的蛋白成分.

在检测PS与NMs结合后所产生的构象变化时，通常使用的是圆二色光谱(circular dichroism)、傅立叶变换红外吸收光谱仪(fourier transform infrared)和表面增强拉曼光谱(surface-enhanced raman spectroscopy)等谱学表征方法.此外，荧光相关光谱法(fluorescence correlation spectroscopy)适用于分析NMs和蛋白的结合力以及蛋白分子层的厚度.Hatami等[36]利用该法，通过荧光淬灭来描述单宁酸与肺液的络合过程.

对NMs与PS的生物物理作用进行定性和定量分析时，可以采用基于耗散监测石英晶体微平衡法(quartz crystal microbalance).Wan等[40]通过Langmuir吸附方程分析石英晶体微平衡法研究数据，确定了动力学和平衡参数，阐明了NMs和由脂质体组成的PS之间的相互作用的性质.

为了可视化NMs与PS之间的相互作用，可考虑粗粒化的分子动力学模拟方法.用这一方法进行表征的好处在于模型中保留了PS体系中必要的化学结构细节信息，定量地描述分子相互作用所造成的影响.焦凤轩等[41]应用这一方法研究了NMs与肺泡表面磷脂膜相互作用的力学机理.

4 结论与展望

NMs具有诸多优势，其应用于肺部疾病治疗的优越性能也越发受到人们关注，然而目前鲜有上市产品.究其原因，主要是NMs进入肺深部后其与PS的相互作用机制尚不明了.为此，近年来很多研究对NMs与PS相互作用过程进行了深入探究，加深了NMs与PS的相互作用对NMs的体内命运及PS生理功能影响的认知，这为研究具有不同生物效应的NMs的设计制备和实际应用提供理论基础.同时，许多表征NMs与PS相互作用的方法被提出，为从微观水平上阐明NMs与PS的相互作用提供了更为丰富的条件.

尽管如此，掌握NMs表面吸附PS形成相互作用复合物的作用机制仍然是一项具有挑战性的任务.探索NMs与PS的相互作用是NMs的生物化学、药理学和毒理学研究的一个非常重要组成部分.阐明NMs与PS相互作用的机制及影响因素，构建NMs与PS相互作用的分子模型，进而主动对NMs表面进行修饰，使其主动吸附PS的某些组分而具有靶向特定细胞的能力，或者规避PS的吸附而提高NMs体内命运的可预测性，这是推动NMs临床转化的潜在研究方向，有待进一步探索.

作者贡献声明

黄郑炜：提出研究方向，撰写文章并对拟发表文章作最后审阅及定稿；钟子乔：整理文献资料，制作图表及撰写文章“相互作用对吸入纳米药物的影响”部分；陈智伟：撰写文章“相互作用的表征方法”部分及修改论文；谢雨珂：撰写文章“相互作用对肺表面活性剂的影响”部分及修改论文；王文浩：确定研究内容及修改文章.

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助且不存在潜在利益冲突.