RASA1通过调控Ras-MAPK通路抑制滋养细胞的增殖迁移功能

2022-01-19张竣张丹瑜刘新琼

暨南大学学报（自然科学与医学版） 2021年6期

张竣, 张丹瑜, 刘新琼

(深圳市人民医院∥暨南大学第二临床医学院计划生育与不孕不育科，广东深圳 518020)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)是指3次及3次以上的自然流产，病因多而复杂，其中半数病因不清，称为不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA).对于已知病因的RSA，可以通过手术、药物等针对病因的治疗，但是对于URSA患者的诊治方面存在很大争议[1].因此，有必要深入研究URSA发生发展的分子生物学机制，为研究URSA的发病及临床治疗提供新的思路与依据.

Ras家族是一类小分子GTP 酶，对于Ras基因、蛋白及其参与的信号转导通路的研究一直是分子生物学的研究热点之一.Ras家族广泛参与细胞的生长、分化、侵袭等，是调节细胞生长和增殖信号通路的重要元件[2].Ras为膜结合型的GTP/GDP 结合蛋白，位于细胞膜内侧，与GTP结合时处于活化状态，与GDP 结合时则为非活化状态[3].Ras基因被活化可激活下游信号分子，造成细胞生长增殖；反之抑制Ras 及其下游信号可抑制细胞增殖和促进细胞凋亡[4].

Ras GTP 酶活化蛋白(Ras GAPs)是调节Ras蛋白活性的酶蛋白分子.Ras GAPs 通过增加Ras 蛋白内在的GTPase 活性，水解Ras GTP 形成Ras GDP，关闭Ras 信号通路而发挥负调控作用[5].Ras p21蛋白活化因子1(Ras p21 protein activator 1，RASA1) 是最早发现的Ras GAPs 之一，相对分子量为120 000，属胞质蛋白[6].其N 端由SH3、SH2、PH及CaLB/C2 等区域组成，C 端是具有催化作用的GTP 酶活化蛋白(GAP) 结构域[7].RASA1 通过GAP相关催化域与活化的Ras (Ras GTP) 结合，激活内在的Ras GTP 酶活性，促进Ras GTP 水解为Ras GDP，从而关闭Ras 信号通路[8].

本课题组既往研究发现， URSA患者绒毛组织中，RASA1基因转录处于异常激活状态，而Ras-MAPK通路则处于失活状态，提示RASA1基因异常激活及Ras-MAPK通路的异常失活可能与URSA的发生密切相关[9].但RASA1在细胞水平对滋养细胞功能的影响仍不清楚.

本研究首先明确RASA1在URSA患者绒毛组织中高表达.随后利用滋养细胞系HTR-8/Svneo细胞进行研究.细胞功能实验发现RASA1可以抑制HTR-8/Svneo细胞Ras-MAPK通路活性，进而抑制HTR-8/Svneo细胞增殖及迁移.结合既往绒毛组织研究结果，提示RASA1-Ras-MAPK调节轴的异常可能是导致URSA的分子生物学机制之一，为URSA的诊治提供了新的思路.

1 材料与方法

1.1 绒毛组织收集

胚胎绒毛组织来源同既往研究[9]：URSA组为在深圳市人民医院计划生育科就诊、孕龄49～63 d、B 超检查未发现原始心管搏动、临床确诊稽留流产、行负压吸引术终止妊娠的URSA患者.对照组为同期同年龄段孕龄49～63 d、既往无任何不良孕产史且至少有一次或以上正常分娩史、本次妊娠无阴道流血等先兆流产症状、彩超检查胚胎发育正常(有胚芽和心管搏动且大小符合孕周)、要求行负压吸引术终止妊娠的健康正常妊娠女性.排除标准：内分泌、外科及内科系统疾病；血栓前状态；女性生殖系统畸形及炎症；夫妻双方染色体及胚胎染色体异常；自身抗体如抗磷脂抗体、抗核抗体、抗DNA 抗体、抗精子抗体、抗甲状腺抗体等；男方精液异常；孕期有剧烈运动、服用含咖啡因类食品、嗜酒等不良生活习惯及嗜好等.本实验通过深圳市人民医院伦理委员会审查批准(编号：LL-KT-201712004).

1.2 细胞培养

滋养细胞系HTR-8/Svneo购买于ATCC细胞库(美国). 细胞接种于含10%胎牛血清(Gibco,美国)的DMEM (Invitrogen, 美国) 培养基中，置于37 ℃、含5% CO2温箱中孵育.细胞培养至对数生长期进行处理及后期实验.

P38/MAPK抑制剂SB203580购买于美国Cell Signaling Technology，用二甲基亚砜(DMSO) 溶解，以5 μmol/L浓度作用于细胞.SB203580对照组用等量的DMSO处理细胞.

1.3 细胞株的转染

RASA1质粒及其对照质粒，以及RASA1特异性siRNA及其对照siRNA均由GenePharma公司(上海)设计及合成.根据Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美国)操作程序转染HTR-8/SVneo细胞.转染RASA1序列质粒为RASA1组，转染对照质粒为Empty Vector组；转染RASA1特异性siRNA为si-RASA1组，转染对照siRNA为si-NC组.

si-RASA1序列：5’- CAUAGAUCACUAUCGAAAATT-3’ (sense sequence),5’- UUUUCGAUAGUGAUCUAUGAT-3’ (antisense sequence).

1.4 Western blot 检测蛋白表达

组织蛋白提取：取-80 ℃冰冻的URSA患者流产胚胎绒毛组织以及其对照正常意外妊娠行人工流产患者绒毛组织，1 mg组织加10 μL RIPA (Thermo Scientific,美国)，并加入蛋白酶抑制剂cocktail(Roche,瑞士)及PMSF (Thermo Scientific,美国)，电动匀浆器低速匀浆30 s，至组织完全裂解.冰上孵育30 min，之后4 ℃、13 000 r/min离心20 min，吸取上清液备用.

细胞蛋白提取：取对数期细胞，细胞裂解液RIPA裂解细胞以提取总蛋白.每孔取细胞蛋白50 μg，蛋白样品至SDS-PAGE 凝胶，电泳完毕后将蛋白电移至PVDF membrane (Roche, 瑞士)，加目标蛋白特异性一抗(1∶1 000, Cell Signaling Technology，美国)，4 ℃ 孵育过夜.PBST 洗涤，HRP Goat-anti-Rabbit (1∶2 000， Santa Cruz Biotechnology，美国)室温孵育1 h，将ECL (Thermo Scientific，美国)加于PVDF 膜上，将凝胶置于凝胶成像分析系统中采集成像.GAPDH antibody (1∶1 000，Cell Signaling Technology，美国)作为内参.利用Quantity One 扫描软件分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参照GAPDH 蛋白条带灰度值之比表示目标蛋白的相对表达水平.

1.5 细胞增殖检测

利用Cell Counting Kit-8 (CCK8) assay (Dojindo, 日本)进行细胞增殖实验.取对数生长期细胞1×103，接种于96 孔培养板，常规培养0、24、48、72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8工作液，继续培养2 h 后，Multifunctional microplate reader SpectraMax M5 (Molecular Devise, 美国)检测450 nm下的吸光值，绘制生长曲线.

1.6 细胞迁移能力检测

将HTR-8/Svneo细胞以1×105/孔分别接种到6 孔板，每组细胞设3 个复孔.5% CO2、37 ℃孵育24 h后用高压消毒过的10 μL移液器枪头于6 孔板底部划出一条宽度约1 mm的无细胞的痕迹，PBS 冲洗3 遍，彻底洗脱划下细胞.加入新鲜无血清培养液继续培养，分时段(0和48 h)在倒置相差显微镜观察划痕边缘细胞迁移情况并拍照，测量划痕愈合的相对距离，计算划痕愈合率.划痕愈合率(%)=(0 h划痕距离-48 h划痕距离)/0 h划痕距离×100%.

1.7 统计学处理

应用SPSS 19.0 统计软件进行分析.所用实验至少重复3 次，采用均数±标准差表示；两组间均数比较采用独立样本t检验；多组间数据的比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验.P<0.05 为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 RASA1抑制滋养细胞Ras-MAPK通路

利用RASA1表达质粒及其特异性siRNA转染HTR-8/SVneo细胞调控其RASA1表达.Western blot结果提示RASA1组与Empty Vector组相比，RASA1表达显著增高；si-RASA1组与si-NC组相比，RASA1表达显著降低(P<0.05，图1A).URSA患者绒毛组织中RASA1表达量显著高于对照组正常妊娠绒毛组织(P<0.05，图1B).Empty Vector组HTR-8/SVneo细胞RASA1表达量与对照组绒毛组织相似；RASA1组HTR-8/SVneo细胞RASA1表达量与URSA组绒毛组织相似(P>0.05，图1B).RASA1组与Empty Vector组相比，Active Ras及Phospho-p38 MAPK蛋白表达量显著降低；而si-RASA1组与si-NC组相比，Active Ras及Phospho-p38 MAPK蛋白表达量显著增高(P<0.05，图1C).结果提示在滋养细胞中，RASA1蛋白可以抑制Ras-MAPK通路.

2.2 RASA1抑制滋养细胞增殖

用CCK-8活细胞计数试剂盒检测HTR-8/SVneo细胞的增殖水平.结果显示，RASA1高表达细胞与其对照细胞相比，细胞增殖速度明显减慢(P<0.05，图2A)；而RASA1低表达细胞与其对照细胞比，细胞增殖速度明显增快(P<0.05，图2B).结果提示RASA1蛋白可以抑制滋养细胞增殖.

A: RASA1蛋白上调对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响.B: RASA1蛋白下调对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响. 1) P<0.05.

2.3 RASA1抑制滋养细胞迁移

用划痕实验检测HTR-8/SVneo细胞的迁移能力.结果显示，RASA1组与Empty Vector组相比，48 h后划痕距离明显较宽(P<0.05，图3A)；而si-RASA1组与si-NC组相比，48 h后划痕距离明显较窄(P<0.05，图3B).提示RASA1蛋白可以抑制滋养细胞迁移.

A: RASA1蛋白上调对HTR-8/SVneo细胞迁移能力的影响.B: RASA1蛋白下调对HTR-8/SVneo细胞迁移能力的影响. 1) P<0.05.

2.4 RASA1通过Ras-MAPK通路调控滋养细胞的功能

利用P38/MAPK抑制剂SB203580逆转si-RASA1 对Ras-MAPK通路的激活作用.Western blot表明，与对照组si-RASA1+NC相比，si-RASA1+SB203580共处理组的Active Ras及Phospho-p38 MAPK蛋白表达量显著降低(P<0.05，图4A)，SB203580可以对抗si-RASA1对Ras-MAPK通路的激活作用.

与si-RASA1+NC共处理对照组相比，si-RASA1+SB203580共处理后，CCK-8实验提示细胞增殖速度显著下降(P<0.05，图4B)；同理，划痕实验提示48 h后划痕距离明显较宽(P<0.05，图4C).结果提示RASA1可能通过调控RAS-MAPK通路，进而影响HTR-8/SVneo细胞增殖及迁移功能.

A: Western bolt检测：P38/MAPK抑制剂SB203580逆转si-RASA1对Ras-MAPK通路的激活作用； B: CCK-8实验：Ras-MAPK通路介导了RASA1对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的调节.C: 划痕实验：Ras-MAPK通路介导了RASA1对HTR-8/SVneo细胞迁移能力的调节. 1) P<0.05.

3 讨论

近期的研究证实，在孕早期Ras-MAPK通路与胎盘组织的发育密切相关，调控着滋养细胞的增殖、侵袭、分化等功能[10-12].Zhu等[13]证实，复发性流产患者的滋养细胞中Ras-MAPK通路处于失活状态，进一步细胞实验证实，激活Ras-MAPK通路可以显著促进滋养细胞增殖.Liu等[12]发现，Ras-MAPK通路可以促进滋养细胞进入细胞周期的S期，从而促进滋养细胞增殖.Wang等[14]发现，Ras-MAPK通路可以调控滋养细胞的侵袭能力，滋养细胞Ras-MAPK通路的异常可能导致复发性流产.

但是，Ras-MAPK通路的失活是否与URSA相关，现仍不清楚.本课题组的既往研究[9]分析了URSA绒毛组织中Ras-MAPK通路核心蛋白的表达量，发现Ras-MAPK通路核心蛋白在URSA绒毛组织中显著低表达，提示Ras-MAPK通路失活可能参与了URSA的发生发展，此结果与Ras-MAPK通路在复发性流产绒毛组织中失活的结论是相似的[12-13].

然而，Ras-MAPK通路在URSA绒毛组织中失活的分子机制，尚未发现相关报道.现有的研究表明，RASA1蛋白可以激活Ras GTP 酶活性，促进Ras GTP 水解为Ras GDP，从而关闭Ras 信号通路，是胞内调节细胞增殖凋亡信号通路的关键分子，即RASA1蛋白可以通过抑制Ras-MAPK通路进而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡[12,15-16].

通过Western Blot证实了URSA患者绒毛组织中RASA1显著高表达，与前期研究提示URSA绒毛组织中RASA1 mRNA高表达的结果是一致的[9].同时，我们发现正常绒毛组织中RASA1表达量与HTR-8/Svneo细胞相似；本研究中转染RASA1质粒时也刻意控制了转染量，让RASA1组HTR-8/Svneo细胞的RASA1表达量与URSA组相似，以达到模拟URSA滋养细胞的目的.故本研究通过比较Empty Vector组及RASA1组HTR-8/Svneo细胞的功能差异，在一定程度上可以说明正常滋养细胞与URSA滋养细胞的差异.

进一步通过细胞实验分析RASA1对滋养细胞Ras-MAPK通路活性的影响，发现RASA1对Ras-MAPK通路确实存在负性调节作用，这与在URSA绒毛组织中发现RASA1高表达、Ras-MAPK通路失活的结果是吻合的，提示在URSA绒毛组织中Ras-MAPK通路的失活与RASA1蛋白密切相关.

随后，通过细胞实验研究RASA1对滋养细胞功能的影响，发现RASA1可以抑制滋养细胞增殖及迁移能力.利用Ras-MAPK通路抑制剂SB203580，研究在Ras-MAPK通路失活的情况下，RASA1对滋养细胞功能的调控的变化.结果显示在抑制了Ras-MAPK通路活性后，si-RASA1对滋养细胞功能的生物学作用也被明显削弱.上述结果提示，RASA1对滋养细胞功能的调控依赖于Ras-MAPK通路.结合既往组织研究的结果，推测滋养细胞中RASA1-Ras-MAPK调控轴的异常导致了URSA的发生发展.