张鹤平 ， 刘建钗 ， 许剑琴 ， 马云飞 ， 刘利强 ， 闫金坤 ， 刘彦威 ， 王九峰

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院 ， 河北 邯郸 056021 ； 2.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193)

肠毒素性大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起断奶仔猪腹泻的重要病因之一。仔猪发生腹泻后死亡率增加、增重下降，给养猪业造成巨大经济损失[1-3]。使用抗生素治疗是目前治疗大肠杆菌腹泻的主要手段。虽然抗生素对仔猪细菌性腹泻有一定疗效，但抗生素的使用会产生细菌耐药、畜产品质量安全等一系列问题。中药对致病性大肠杆菌有直接或间接杀灭作用，可调节动物机体免疫力，具有疗效可靠、毒副作用小、不易产生耐药性等优点。中药可通过调节细胞因子、修复肠组织结构、抗内毒素(ET)等机制，起到调节机体免疫功能、抗炎等作用[4-5]。白苦败痢散由白头翁、苦参、败酱草、厚朴、葶苈子组成[6]。本试验建立仔猪大肠杆菌腹泻模型，使用中药白苦败痢散治疗，结合剖检变化、组织病理切片，观察临床疗效，为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 35日龄断奶仔猪48头(28日龄断奶)，杜长大三元杂交，购自河北省邯郸某猪场，仔猪健康，没有接种过大肠杆菌菌苗。购进后常规饲养 1周，观察仔猪无异常情况后再进行试验。

1.2 试验药物 白苦败痢散，批号：20160301；规格0.5 g/g，每1 g散剂中含0.5 g生药；推荐使用剂量2 g/(kg·bw)。拌料用。中试厂家：北京中农劲腾生物技术股份有限公司。恩诺沙星溶液：含量5%，规格2 mL/支。每头仔猪口服2 mL，1 次/d，深圳华泰动物药业有限公司。

1.3 菌株 猪源肠毒素性大肠杆菌(ETEC)，编号:CVCC225，血清型O149：K91，K88 ac，该菌分离自腹泻新生仔猪小肠黏膜。由中国农业大学临床兽医学实验室提供。

1.4 主要试剂 4%多聚甲醛，购自北京索莱宝科技有限公司；甲醛、无水乙醇、95%乙醇、二甲苯，均购自中国国药集团化学试剂有限公司。

1.5 大肠杆菌菌液的制备 将复壮过的大肠杆菌接种于肉汤培养基，37 ℃过夜培养，涂板法细菌计数。无菌吸取0.1 mL菌液至灭菌试管，加0.9 mL灭菌生理盐水，做10倍倍比稀释。分别取10-5、10-6、10-7、10-8稀释梯度的菌液100 μL，涂布于无菌营养琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱培养18 h，计数。根据菌落计数结果，配成菌液浓度3×109CFU/mL的菌悬液(4 ℃备用)。

1.6 动物分组及处理

1.6.1 攻毒、试验分组 将48头35日龄断奶仔猪，饲养观察1周，随机分为空白对照组、感染对照组、白苦败痢散高剂量组、白苦败痢散中剂量组、白苦败痢散低剂量组和药物对照组，每组8头。饲养观察结束后，除空白对照组外，其他仔猪灌服3×109CFU/mL菌液(根据预试验确定每头仔猪50 mL)，1次/d，连续灌服3 d，攻菌造模。造模后，空白对照组、感染对照组仔猪灌服50 mL生理盐水；白苦败痢散高、中、低剂量组分别按4、2 g/(kg·bw)和1 g/(kg·bw)剂量，用生理盐水稀释成50 mL药液灌服，药物对照组灌服恩诺沙星，2 mL/头，1次/d，连用5 d。仔猪按分组隔离饲养，处理期间仔猪正常饲喂，自由采食，自由饮水。每天07:00～08:00、19:00～20:00观察记录仔猪精神、被毛、采食、腹泻及死亡状况。

1.6.2 生产性能测定 仔猪攻毒3 d后，分别在试验前、试验结束后空腹称重，并记录各组仔猪采食量，计算日增重。

平均日采食量=(配料总量-剩料量)/(试验天数×每组试验猪数)

平均日增重=(试验末平均体重-初期平均体重)/试验天数

1.6.3 动物处理及样品采集 试验结束后，各组仔猪颈静脉采血，抗凝血采集2 mL，用于血液常规分析，采血后颈部放血处死。打开腹腔，观察腹腔脏器病理变化。采集空白对照组、感染对照组、白苦败痢散高、中、低剂量组及药物对照组仔猪空肠、回肠组织中段1.5 cm，分别标记并保存于4%多聚甲醛固定，用于H.E.染色，以观察肠道组织学病理变化。

1.6.4 疗效判定 试验结束后对腹泻症状消失的仔猪，无菌采集粪便检测攻毒菌清除情况。根据所观察临床表现，按下述标准判断疗效。

治愈：治疗后腹泻症状消失、肛门周围无污物。无菌取仔猪肠道粪便进行分离、培养，分离不到致病性大肠杆菌。治愈率=治愈数/每组仔猪总数×100%。

有效：治疗后临床症状得到部分缓解或完全恢复，腹泻次数减少或正常，粪便变稠或正常，精神状态、食欲有明显好转或正常。有效率=有效数/每组仔猪总数×100%。

无效：治疗后临床症状无明显改善，仔猪腹泻未得到改善，甚至出现死亡。

1.7 数据分析 统计分析使用SPSS 20.0软件进行分析。

2 结果

2.1 白苦败痢散治疗腹泻仔猪的疗效

2.1.1 临床疗效 从腹泻症状停止的仔猪粪便中未分离到致病性大肠杆菌，统计为治愈仔猪。白苦败痢散治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的临床疗效结果见表1。白苦败痢散高、中、低剂量组的治愈率分别为62.5%、62.5%和37.5%，有效率分别为87.5%、75.0%和62.5%。药物对照组治愈率为75.0%，有效率为87.5%。

表1 白苦败痢散治疗仔猪腹泻的临床疗效Table 1 Clinical effect of Baikubailisan on diarrhea piglets (头，%)

2.1.2 白苦败痢散对腹泻仔猪生产性能的影响 结果见表2。试验结束时，感染对照组仔猪日增重低于空白对照组，差异显著(P<0.05)；白苦败痢散高、中剂量组仔猪日增重高于感染对照组，差异显著(P<0.05)；白苦败痢散高、中剂量组仔猪日增重与药物对照组相比，差异不显著(P>0.05)。

表2 白苦败痢散对腹泻仔猪生产性能的影响Table 2 Effect of Baikubailisan on growth performance of diarrhea piglets (kg)

2.2 血液学指标变化 结果见表3。给药5 d后，红细胞计数(RBC)各组差异不显著(P>0.05)。白细胞计数(WBC)感染对照组高于空白对照组，差异显著(P<0.05); 白苦败痢散低剂量组低于空白对照组，差异显著(P<0.05)；白苦败痢散中、高剂量组低于感染对照组，差异极显著(P<0.01)。中性粒细胞计数(Gran)感染对照组高于空白对照组，差异显著(P<0.05)；白苦败痢散低剂量组低于感染对照组，差异显著(P<0.05)；白苦败痢散中、高剂量组低于感染对照组，差异极显著(P<0.01)。

表3 白苦败痢散对仔猪大肠杆菌腹泻血液学指标的影响Table 3 Effect of Baikubailisan on haematological indexes of Escherichia coli diarrhea piglets

2.3 剖检变化、肠组织形态结构观察

2.3.1 剖检变化 空白对照组仔猪十二指肠、空肠、回肠、结肠无明显病理变化(图1)。感染对照组空肠、回肠充血，肿胀，肠系膜充血。白苦败痢散中、高剂量组和药物对照组仔猪空肠、回肠恢复正常，无充血、肿胀。

图1 仔猪剖检变化Fig.1 Changes of piglets in autopsyA: 感染对照组； B: 白苦败痢散中剂量组； C: 药物对照组A: Infected control group; B: Baikubailisan medium-dose group; C: Drug control group

2.3.2 肠组织形态学观察 空白对照组空肠黏膜结构基本正常(图2)，黏膜上皮形态正常，柱状细胞排列整齐。感染对照组仔猪空肠可见绒毛部分脱落，散落在肠腔中，黏膜上皮受损，炎性细胞浸润。白苦败痢散高、中剂量组、药物对照组治愈的仔猪空肠黏膜层结构趋于完整。

图2 空肠组织结构变化(H.E.染色，200×)Fig.2 Structural changes of jejunum (H.E.staining,200×)A： 空白对照组； B： 感染对照组； C： 白苦败痢散中剂量组； D： 药物对照组箭头: 肠黏膜脱落，炎性细胞浸润A: Blank control group; B: Infected control group; C: Baikubailisan medium-dose group; D: Drug control group Arrow: Intestinal mucosa shedding and inflammatory cells infiltrating

空白对照组仔猪回肠结构组织完整(图3)，绒毛整齐，轮廓清晰；感染对照组回肠黏膜层受损严重，黏膜大面积脱落，炎性细胞浸润；白苦败痢散高、中剂量组和药物对照组治愈的仔猪回肠黏膜层结构趋于完整。

图3 回肠组织结构变化(H.E.染色, 200×)Fig.3 Changes of tissue structure of ileum in piglets(H.E.staining, 200×)A： 空白对照组； B： 感染对照组； C： 白苦败痢散中剂量组； D： 药物对照组箭头： 上皮黏膜脱落A: Blank control group; B: Infected control group; C: Baikubailisan medium-dose group; D: Drug control group Arrow: The epithelial mucosa was exfoliated

3 讨论

动物腹泻模型是研究动物腹泻发生机制、中兽药治疗动物腹泻疗效及其机理的常见方法。张赛奇用3×109CFU/mL大肠杆菌液5 mL/(10kg·bw)灌服21日龄断奶仔猪，连续灌服菌液3 d，建造了仔猪腹泻模型[7]。本试验按照预试验确定的攻菌剂量用3×109CFU/mL菌液50 mL连续给仔猪灌服3 d，成功建立了仔猪大肠杆菌性腹泻模型。

ETEC导致仔猪腹泻是通过在小肠定植以及产生肠毒素而发生的[8]。ETEC黏附于上皮细胞的刷状缘，破坏细胞连接，导致肠道炎症和腹泻[1]。本试验中感染对照组仔猪空肠、回肠黏膜充血，水肿，说明ETEC引起了断奶仔猪小肠炎症反应。白苦败痢散治疗后仔猪空肠、回肠黏膜结构趋于完整，说明白苦败痢散有助于腹泻仔猪小肠组织结构的恢复，起到治疗仔猪腹泻的作用。

白细胞总数通常用于评估严重细菌感染的风险，白细胞数量的增加表明存在系统性炎症[9]。细菌感染后，中性粒细胞通过增加骨髓干细胞转化能力、增加炎性产物的生成等，应对细菌感染，以清除侵入机体的细菌[10]。本试验结果表明，给药5 d后，攻毒后腹泻仔猪与空白对照组相比，白细胞数、中性粒细胞百分比差异显著，说明断奶仔猪受到病菌感染发生炎症；白苦败痢散高、中、低剂量组仔猪与空白对照组相比，红细胞数、白细胞数、中性粒细胞百分比差异不显著，各血液学指标恢复正常，说明仔猪腹泻症状停止或减轻，炎症消失或减轻、机体脱水状况得到改善。

4 结论

中、高剂量白苦败痢散治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的有效率分别为75.0%和87.5%。白苦败痢散治疗后，仔猪的生产性能得到明显改善。