孙建政，孙国君，王晓娜，沈思军，李 劼

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000）

饲料青贮发酵是一个复杂的微生物变化过程，参与青贮过程的微生物种类众多，主要有腐败菌、霉菌、芽孢杆菌、乳酸菌（LAB）等，这些微生物存在于青贮原料、青贮发酵过程中和发酵完成后的开窖使用阶段[1]。LIN等[2]分析紫花苜蓿等青贮原料上的微生物种类，发现其中主要是肠杆菌、酵母菌和霉菌，LAB只占到微生物总数的5%。腐败菌、霉菌或其它杂菌的存在会影响LAB的繁殖，不利于青贮的开始或后期进行，从而造成青贮品质的降低，因此抑制有害微生物的繁殖是提高青贮饲料品质，乃至青贮成败的关键。植物精油是一类易挥发、可随水蒸气蒸馏出来的油状液体的总称，是植物的次生代谢物质，具有显著的抑菌或杀菌活性。近年来研究发现，在饲料青贮中添加肉桂精油、薄荷精油、百里香精油以及柠檬草精油等植物精油，均可有效改善青贮饲料的发酵品质和有氧稳定性[3-5]。

苜蓿缓冲度高，可溶性碳水化合物（WSC）含量低，单独青贮较难，一般采用苜蓿混合青贮或在苜蓿青贮原料中加入添加剂，调制苜蓿青贮饲料。松针是松科松属植物的叶子，不仅富含氨基酸、微量元素、维生素，还含有精油、黄酮、有机酸等活性物质。前苏联科研人员发现，将落叶松针与苜蓿按1∶1比例混合制成青贮饲料，pH值和产气量最低，青贮饲料中微生物发酵过程和生命活动都受到极大抑制[6]。谭秀丽等[7]在苜蓿青贮饲料中添加10%、30%和50%的松针，也取得良好效果。TURAN A等[8]研究发现，孜然精油能够提高苜蓿青贮的发酵品质和有氧稳定性，同时影响其化学和微生物特性。笔者认为，在松针和苜蓿混合青贮过程中及开窖后，松针精油对青贮饲料中微生物的活动起到较强的抑制作用，进而改善青贮饲料的品质。迄今，国内外有关松针精油对青贮饲料品质影响的研究尚未见报道。因此，本试验以松针精油为青贮饲料添加剂，研究松针精油对苜蓿青贮饲料营养成分和发酵品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

松针精油：以樟子松松针为原料，水蒸气蒸馏法提取松针精油，气相色谱质谱联用技术（GC-MS）进行化学成分分析[9]，化学成分如表1所列。

表1 松针精油的主要化学成分及含量Table 1 The main chemical constituents and contents of pine needle essential oil

紫花苜蓿：苜蓿青贮原料，2020年6月初花期（第二茬）收割于石河子大学动物科技学院牧草试验田。

1.2 试验设计

采用单因子试验设计，共设4个组，每组3个重复。紫花苜蓿收割后枯萎3h，切成1.0～2.0cm小段。将1.6、3.2和4.8g松针精油（精油浓度为0.9g·mL-1）分别溶解于100mL70%乙醇中，按100mL混合液∶10kg青贮原料（鲜重）的比例，喷洒在苜蓿原料表面，喷洒后立即搅拌均匀，使松针精油在每千克青贮原料（鲜重）中含量分别为160mg·kg-1（PNE1）、320mg·kg-1（PNE2）和480mg·kg-1（PNE3），对照（CK）均匀喷洒等体积70%乙醇。喷洒后立即搅拌均匀，装入聚乙烯包装袋，真空密封。放置室温环境下发酵60d后，开袋取样，测定各项指标。

1.3 测定指标

1.3.1 感官评定

依据德国农业协会青贮质量感官评分标准从色泽、气味和质地3个方面进行等级评定[10]。气味3个等级（0～14分），质地4个等级（0～4分），色泽3个等级（0～2分）。最后综合三项得分，依次评定为1级16～20分（优良）、2级10～15分（尚好）、3级5～9分（中等）和4级0～4分（腐败）。

1.3.2 营养成分分析

参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[11]，测定青贮饲料中干物质（DM）、粗蛋白质（CP）、酸性洗涤纤维（ADF）和中性洗涤纤维（NDF）含量。

相对饲喂价值（RFV）参考王郝为等[12]方法计算：

RFV＝DMI（%BW）×DDM（%DM）/1.29（以绵羊为动物基础）

其中，DMI（%BW）＝120/NDF（%DM），DDM（%DM）＝88.9－0.779×ADF（%DM）。式中BW为体重；DMI为粗饲料干物质采食量，单位为%BW；DDM为可消化的干物质，单位为%DM。

1.3.3 发酵品质

pHSJ-5型智能酸度计测定pH值。苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮（NH3-N）含量[13]，计算NH3-N与总氮的比例（NH3-N/TN）。对羟基联苯比色法测定乳酸（LA）含量[14]。蒽酮比色法测定WSC含量[15]。岛津高效液相色谱仪测定乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）含量[16]。

1.3.4 青贮微生物数量分析

各处理分别取5g新鲜的青贮样品加入装有45mL灭菌水的三角瓶中，室温，180r·min-1，离心30min。取上清液用无菌水稀释成10-1～10-77个浓度梯度。每个稀释梯度分别取20μL涂布在相应培养基上，同时做两个平行样。LAB在MRS琼脂上37℃培养48h并计数，酵母菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上28℃培养24h并计数，霉菌在察氏琼脂培养基上28℃培养72h并计数，好氧细菌（AB）在营养琼脂培养基上30℃培养24h并计数。

1.3.5 有氧稳定性测定

取1000g苜蓿样品置于自封袋中，不封口，用量程为50℃的普通温度计插入青贮饲料中心测定温度变化。样品避光保存，环境温度根据实际情况确定，当青贮饲料的温度超过环境温度2℃时为止。

1.4 数据处理

利用Excel 2013软件整理试验数据，SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，试验数据用平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 苜蓿青贮的感官评定

如表2所列可知各处理苜蓿青贮饲料的感官评定得分，其中CK具有微弱的丁酸味，茎叶结构保持较差，呈黄绿色，等级为2级尚好。PNE1、PNE2和PNE3等级均为1级优良，表现为茎叶结构保持良好，呈黄绿色，具有松脂味。

表2 不同处理组苜蓿青贮的感官评分Table 2 Sensory evaluation of the alfalfa silage in different treatment groups

2.2 松针精油对苜蓿青贮营养成分的影响

如表3所列可知，各组苜蓿青贮的DM含量均无显著差异（P＞0.05）；松针精油处理CP含量均显著高于CK（P＜0.05），各精油处理间差异不显著（P＞0.05）；各精油处理NDF含量与CK相比均显著降低（P＜0.05），其中PNE2和PNE3显著低于PNE1（P＜0.05），而PNE2和PNE3间差异不显著（P＞0.05）；各精油处理ADF含量均显著低于CK（P＜0.05），随松针精油浓度增加，ADF含量呈降低趋势，且处理间差异显著（P＜0.05）；各精油处理苜蓿青贮的RFV显著高于CK（P＜0.05），随松针精油浓度增加，RFV呈升高趋势，且处理间差异显著（P＜0.05），其中PNE3的RFV含量最高。

表3 松针精油对苜蓿青贮营养成分和相对饲喂价值的影响（干物质基础，单位：%）Table 3 Effect of pine needle essential oil on the nutritional components and relative feeding value of alfalfa silage（DM basis）

2.3 松针精油对苜蓿青贮发酵品质的影响

如表4所列可知，随松针精油浓度增加，pH值呈降低趋势，各精油处理pH值均显著低于CK（P＜0.05），其 中PNE3显 著 低 于PNE1和PNE2（P＜0.05），PNE1与PNE2间差异不显著（P＞0.05）；各精油处理NH3-N/TN含量与CK相比均显著降低（P＜0.05），PNE2和PNE3间差异不显著（P＞0.05），且均低于PNE1（P＜0.05）；各精油处理的WSC含量均显著 高 于CK（P＜0.05），PNE3显 著 高 于PNE1和PNE2（P＜0.05），但PNE1与PNE2间差异不显著（P＞0.05）；在LA含量表现上，CK和PNE1间无明显差异（P＞0.05），PNE2和PNE3间差异不显著（P＞0.05），但PNE2和PNE3显著高于CK和PNE1（P＜0.05）；PNE3的AA含量显著低于CK、PNE1和PNE2（P＜0.05），但CK、PNE1和PNE2间差异不显著（P＞0.05）；PNE3的PA含量显著高于CK、PNE1和PNE2（P＜0.05），但CK、PNE1和PNE2间差异不显著（P＞0.05）；CK中能检测出少量BA，其他精油处理中均未检出。

表4 松针精油对苜蓿青贮饲料发酵品质的影响（干物质基础）Table 4 Effect of pine needle essential oil on the fermentation quality of alfalfa silage（DM basis）

2.4 松针精油对苜蓿青贮微生物数量的影响

如表5所列可知，各精油处理苜蓿青贮的LAB数量均显著高于CK（P＜0.05），其中PNE3显著高于PNE1和PNE2（P＜0.05），PNE1与PNE2间无明显差异（P＞0.05）；各精油处理的酵母菌类数量均低于CK（P＜0.05），PNE1与PNE2间差异不显著（P＞0.05），PNE3显著 高于PNE1（P＜0.05），PNE3与PNE2间差异不显著（P＞0.05）；各精油处理AB数量均低于CK（P＜0.05），PNE3显著高于PNE1和PNE2（P＜0.05），而PNE1与PNE2间差异不显著（P＞0.05）。在CK中检测到少量霉菌，各精油处理中均未检出。

表5 松针精油对苜蓿青贮中微生物数量的影响（单位：log10CFU·g-1·FM）Table 5 Effect of pine needle essential oil on microbial counts in alfalfa silage

2.5 松针精油对苜蓿青贮有氧稳定性的影响

如图1所示可知，CK、PNE1、PNE2和PNE3的有氧稳定性时间分别为156h、184h、212h和285h，各松针精油处理均显著高于CK（P＜0.05），各精油处理间差异显著（P＜0.05），随精油浓度增加，各精油处理的有氧稳定性时间也显著增高（P＜0.05）。

图1 松针精油对苜蓿青贮饲料有氧稳定性的影响Figure 1 Effect of pine needle essential oil on the aerobic stability of alfalfa silage

3 讨论

3.1 松针精油对苜蓿青贮营养成分的影响

本试验中，添加松针精油对苜蓿青贮饲料的DM含量无明显作用，这与TURAN A等[8]在苜蓿青贮中添加孜然精油的研究结果相似。这可能是因为在青贮前，对各组原料进行凋萎处理，含水率下降减少了青贮饲料的渗液损失。同时，在一定程度上抑制不良发酵，降低营养物质的损耗。紫花苜蓿的蛋白降解主要依靠植物蛋白酶和微生物蛋白酶两者的共同作用[17]，青贮过程中pH值的变化对植物蛋白酶活性和微生物繁殖有很大影响，降低pH值可抑制蛋白酶活性[18]。本试验显示，松针精油处理苜蓿青贮中CP含量均显著高于CK，其原因是添加松针精油，抑制有害菌繁殖，促进LAB生长，青贮饲料中LA水平提高，pH值降低，从而降低蛋白质的损失。

现有研究表明，在苜蓿青贮饲料[8]、全株玉米青贮饲料[19]中添加孜然精油，在甘蔗青贮饲料中添加柠檬草精油[5]，可降低青贮饲料中NDF和ADF含量，本试验结果与上述结果相似。另外，随松针精油浓度增加，苜蓿青贮饲料中NDF和ADF含量显著降低，主要原因是松针精油抑制青贮发酵过程中有害菌的作用，降低WSC和蛋白质的损失，从而使NDF和ADF含量相对降低。TURAN A等[8]认为，孜然精油通过刺激相关酶的活性，使植物细胞壁分解。NDF和ADF含量降低，也可能是受pH值降低影响。但CHAVES A V等[20]研究发现，在大麦青贮中添加肉桂精油（120mg·kg-1DM），NDF和ADF含量反而高于对照组，添加等量牛至精油却不影响NDF和ADF含量。这可能与精油种类及添加剂量等因素有关，其原因还有待深入研究。

饲料中NDF和ADF含量与RFV密切相关，NDF和ADF含量降低，RFV升高。本试验中，随松针精油浓度增加，苜蓿青贮饲料中NDF和ADF含量显著降低，其RFV显著提高。

3.2 松针精油对苜蓿青贮发酵品质的影响

本试验显示，松针精油处理苜蓿青贮pH值均显著低于CK，原因是松针精油能够抑制酵母菌、霉菌和AB等有害微生物的繁殖，使LAB迅速占据优势地位，同时LAB代谢产生大量LA，从而快速降低苜蓿青贮的pH值。HODJATPANAH M A等[21]在玉米青贮中添加120mg·kg-1、240mg·kg-1的薄荷精油、孜然精油、百里香精油和牛至精油，发现仅240mg·kg-1薄荷精油可显著降低其pH值，说明不同种类精油以及添加剂量对青贮发酵品质的影响不同。NH3-N/TN是反映青贮过程中蛋白质降解程度的指标，NH3-N/TN越低，青贮饲料品质越好。本试验在苜蓿青贮中添加松针精油，显著降低NH3-N/TN，这与在青贮饲料中添加植物精油可显著降低NH3-N/TN水平的已有研究结果相似[3，8]。其主要原因是植物精油有抑制青贮饲料中酵母菌、梭状芽孢杆菌等有害菌的生长，提高LAB数量的作用，这减少了蛋白质的分解，从而导致青贮饲料中NH3-N的产生减少。优质青贮饲料中LA的含量比例较高，BA含量较低[22]。本试验在苜蓿青贮中添加松针精油后，LA和PA含量升高，AA含量降低，BA未检出。BA是由腐败菌和梭状芽孢杆菌分解蛋白质、葡萄糖和LA而生成的产物[23]，松针精油处理组均未检出BA，表明松针精油能够有效抑制梭状芽孢杆菌的生长，提高苜蓿青贮的发酵品质。

植物精油具有杀菌、抑菌作用，在青贮饲料中可抑制有害菌，促进有益菌生长。本试验也进一步证明，添加松针精油后，可抑制苜蓿青贮中酵母菌、AB和霉菌等有害菌的生长，促进LAB的生长。

3.3 松针精油对苜蓿青贮有氧稳定性的影响

有氧稳定性决定青贮饲料暴露在空气中的质量和安全性，有氧稳定性时间越长说明青贮饲料暴露在空气中发生腐败变质所需的时间越长，安全性越高。在青贮饲料中添加植物精油可改善青贮的有氧稳定性已有报道[3，8，24]，本试验在苜蓿青贮中添加松针精油也取得相似结果，提高了青贮饲料的有氧稳定性。大量研究表明，青贮开封后，耐酸的好氧微生物首先开始利用LA和WSC大量繁殖，使得pH值升高，进而不耐酸的微生物开始繁殖，有害微生物占据主要地位，导致青贮腐败变质[25，26]。本研究中精油处理的有氧稳定性显著高于CK，且有氧稳定性随松针精油浓度增加而提高，这可能是由于松针精油能抑制酵母菌和霉菌等有害微生物的生长，抑制青贮饲料开封后的二次发酵，进而有力证明添加松针精油可提高苜蓿青贮的有氧稳定性。

4 结论

苜蓿青贮中添加松针精油可提高苜蓿青贮中CP和WSC的含量，降低pH值，同时NH3-N、NDF和ADF的含量也降低。松针精油可抑制苜蓿青贮中酵母菌、霉菌和AB的生长，提高苜蓿青贮的有氧稳定性，从而改善苜蓿青贮饲料的品质。