张淑娟, 牛 铮，阚子斐，张依玲，徐沙沙，邹 宏，张静怡，宋振辉，2

(1. 西南大学动物医学院，重庆 荣昌 402460 ； 2.西南大学医学研究院免疫学研究中心，重庆 荣昌 402460)

猪流行性腹泻易感宿主为各个年龄段的猪，症状的轻重随年龄的大小而有所不同，其中以新生仔猪最为严重[1]。最近几年，猪消化道疾病中猪流行性腹泻发病率、死亡率明显提高,流行特点和发病症状也发生了一定的改变。猪流行性腹泻病毒传播途径主要是直接、间接接触和气溶胶传播[2]。猪感染后，病毒主要是在小肠黏膜上皮细胞中复制。由于病毒增殖首先造成机体小肠上皮细胞正常结构被破坏,继而出现细胞功能障碍。肠绒毛出现萎缩、脱落、空泡化，造成了肠壁变薄，吸收表面积减少，同时干扰肠道菌群(GM)的平衡，降低益生菌的数量，从而使小肠吸收消化功能降低；另外，肠黏膜上皮细胞内的碱性磷酸酶(ALP)、氨基肽酶(APs)等活性降低或者缺乏，导致肠腔无法将小分子物质进一步分解、吸收，致使营养物质吸收障碍，肠腔内的胶体渗透压升高，同时，因为ATP酶含量显著减少，肠上皮细胞内钠泵机制失活，从而引发仔猪Na+失衡性腹泻，严重时脱水甚至死亡-这是导致病猪死亡的主要原因[3]。猪流行性腹泻发病日龄低、发病急且死亡率高，患病仔猪不能及时产生主动免疫，所以免疫接种是预防该病的主要手段。2010年以来，Kim等发现全球开始出现猪流行性腹泻病毒变异体[4]，导致其传统疫苗在很大程度上失去了保护作用,因此更加迫切需要有效地措施预防该病。在畜牧业中，常将益生菌代替抗生素作为饲料添加剂预防传染病的发生，其中部分益生菌有较明显的抗猪流行性腹泻病毒效果。运用益生菌(如乳酸杆菌、芽孢杆菌等)能够很有效地减弱猪流行性腹泻病毒的活性，使有益菌在体内大量定植、快速繁殖,增加肠道内有益菌的数量,从而调整肠道内的微生态平衡,在一定程度上可以预防猪流行性腹泻。

1 猪流行性腹泻(PED)的致病机理

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(α-Coronavirus)，是具有包膜的单股正链RNA病毒，其结构如图1所示，组成蛋白主要包括：S蛋白(Spike protein)、E蛋白(Envelope protein)、N蛋白(Nucleocapsid protein)、M蛋白(Membrane protein)和ORF3蛋白等[5]。S蛋白是病毒粒子表面的纤突蛋白，当细胞表面的受体与病毒粒子结合后，S蛋白就会通过膜融合方式侵入到机体细胞并介导宿主产生中和抗体。S蛋白又可以分为S1和S2两个亚基，猪流行性腹泻病毒的S1亚基具有高度变异性，负责识别和结合特异性受体，S2亚基与病毒-细胞融合有关且相对保守。S1亚基分为功能域和结构域，结构域又分为N端域(NTD)和C端域(CTD)。NTD和CTD结构域有可能结合不同的受体，特别是碳水化合物或跨膜蛋白。多数蛋白质受体与CTD结构域结合[6]。M蛋白和E蛋白参与形成病毒包膜，N蛋白与病毒基因组一起形成核衣壳。

图1 猪流行性腹泻病毒结构

目前研究表明，猪流行性腹泻病毒入侵细胞的过程为：S糖蛋白与细胞受体结合后，被某种蛋白酶剪切后活化成一种融合肽，再通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导该病毒侵入宿主细胞，进而释放具有感染性的基因组RNA，同时核衣壳蛋白N也被释放进胞质中[7]。因此，受体是病毒侵入宿主的主要途径。最初研究表明，氨基肽酶N是血清型I冠状病毒的主要细胞受体，并且可能是猪流行性腹泻病毒进入细胞的主要受体，但宋利娜等最新研究证实，猪小肠绒毛肠细胞表达的氨基肽酶N(APN)为α-冠状病毒的主要受体，但却不是猪流行性腹泻病毒所必需的功能受体[8]。目前虽然有用于预防猪流行性腹泻的相关疫苗(如CV777疫苗株)，但随着猪流行性腹泻病毒基因型的不断变异，其保护效力大幅降低，现在最为迫切的是对该病进行有效的防控。

2 益生菌的功能

益生菌是通过定植在机体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或肠道内菌群平衡，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物，起到促进营养吸收、保持肠道健康的作用。目前文献报道中常用的益生菌有酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等[9]。

2.1 维持肠道菌群结构平衡 当病原菌入侵时肠道菌群生态平衡就会失调。益生菌在肠道内定植,可大量繁殖成为肠道中有益的正常菌群,以维持肠道内菌群平衡。同时，益生菌可抢占其他病原菌的生存空间和养分或自身分泌杀菌物质等，使得病原菌没有生存的空间；并且部分益生菌(如双歧杆菌)中有硝化菌，可阻止动物自身及许多致病菌产生的毒性胺和氨的合成，净化动物肠道微生态环境；益生菌也可直接作用于肠黏膜免疫系统，促使肠道分泌肠黏液，降低肠黏膜渗透性,以保护肠道黏膜屏障的完整性[10]。

2.2 抑制致病菌的生长和繁殖 益生菌与致病菌竞争定植位点或争夺营养物质，从而抑制致病菌的生长和繁殖。益生菌可刺激动物免疫器官的生长发育,激活体内具有吞噬作用的T、B淋巴细胞,提高抗体、干扰素和免疫球蛋白水平，增强动物细胞免疫和体液免疫功能，缓解机体的炎症反应等[10]。例如干酪乳杆菌(LcS)可以调节天然杀伤细胞的活性。鼠李糖乳杆菌(LGG)可以调节先天性和适应性免疫反应，尤其针对胃肠道病原体的免疫反应，从而导致血清IgG和分泌型IgA水平升高[11]。并且，益生菌自身会产生抗菌物质，如戊糖乳杆菌产生的细菌素Pentocin JL-1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)具有良好的抑制活性[12];乳酸菌、双歧杆菌、优杆菌等定植到肠道后，会产生大量有机酸(如乙酸)和具有抗菌、增强免疫等作用的活性化合物，对病原菌的定植和生长产生抑制作用[13-14]。

2.3 提高机体抗氧化水平 机体中氧化物(氧自由基和羟基自由基等)，含有未配对的电子，容易发生氧化还原反应，当机体中的氧化物过量时会导致机体产生氧化损伤。机体中存在着抗氧化系统，可以不断的清除机体合成的氧化物，维持着氧化物的动态平衡。植物乳杆菌C88分泌的多糖通过清除活性氧、上调酶促和非酶促抗氧化剂活性、减少脂质过氧化从而发挥抗氧化作用[15]。植物乳杆菌LPZ菌株能够提高断奶仔猪生长性能，降低腹泻发生率，该菌株能够提高机体免疫力和抗氧化能力，提升肠道短链脂肪酸的含量[16]。

3 益生菌的抗病毒机制

益生菌可通过直接或间接两种方式来抑制病毒。益生菌与病毒直接相互作用，通过与病毒竞争性结合受体来阻止病毒吸附；间接方式可借助益生菌本身产生的代谢产物等来减弱病毒的致病力,其机制如图2所示。

图2 益生菌抗病毒机制A:益生菌与病毒结合； B:益生菌捕获病毒颗粒； C:益生菌掩盖细胞特异性受体； D:益生菌竞争性结合细胞受体; E:益生菌代谢产物作用于病毒； F:益生菌刺激肠上皮细胞分泌黏液; G:益生菌干扰病毒周期； H:益生菌调节免疫机制

3.1 益生菌-病毒直接相互作用 益生菌可以直接作用于病毒从而干扰其复制；还可以与病毒结合来阻断其对宿主细胞受体的附着；另外，益生菌还能捕获病毒颗粒抑制其进入细胞。例如，从人类阴道分离出的加氏乳杆菌CMUL57就是通过直接相互作用来抑制单纯疱疹病毒(HSV-2)的入侵；松果乳杆菌在单纯疱疹病毒(HSV-2)的吸附和繁殖过程中未发现明显的抑制作用，而是在最初感染阶段就通过捕获病毒颗粒来抑制病毒进入细胞[17]。

3.2 益生菌-受体相互作用 益生菌表面的黏附素会先一步黏附在病原微生物的结合靶点上，以此掩盖特异性或非特异性受体，从而阻止病毒侵入宿主[18]。此外，益生菌还可诱导上皮细胞产生抗病毒物质来抑制病毒繁殖，并与病原体竞争附着在细胞受体上，以防止病毒入侵细胞(如乳酸菌)[17]。猪流行性腹泻病毒感染宿主的前提是先结合猪小肠上皮细胞上的相应受体靶点，而益生菌产生的黏附物质可能会先黏附在靶细胞受体上，从而阻止猪流行性腹泻病毒侵入宿主，相关机制有待进一步研究。

3.3 代谢产物-病毒相互作用 益生菌培养过程中产生的代谢产物对病毒有一定的抑制作用，且不会显著干扰其他微生物菌群。在临床上，益生菌产生的胞外多糖(EPS)安全无害且具有靶向性，可以刺激IL-12的合成和积累，从而增强自然杀伤细胞的活性和脾脏中IgA的合成。例如，乳酸菌产生的EPS可用于腺病毒的治疗[19]。但是，并非所有乳酸菌菌株产生的EPS都能抗病毒，其取决于乳酸菌菌株的生物活性。另外，植物乳杆菌能够分泌一种双肽细菌素(Plantaricin EF，Pln EF)诱导肠上皮强化，增强肠道屏障功能，预防猪流行性腹泻、传染性胃肠炎等肠道传染病[20]。

3.4 益生菌-机体相互作用 益生菌通过调节机体的免疫机制，如上调干扰素、白细胞介素等细胞因子水平以及提高血清、粪便中特异性IgA水平，以此增强机体的抗病毒的能力，缓解机体炎症反应。干扰素(IFN)可以有效防治猪腹泻，刘延亭等[21]用乳酸菌菌株表达的重组IFN-α等干扰素对猪流行性腹泻病毒抑制效果最好。植物乳杆菌(Lp-1)通过刺激IPEC-J2或ST细胞内IFN-β介导的JAK1/STAT通路发挥抗传染性胃肠炎病毒的作用，导致干扰素刺激基因(ISGs)上调，从而诱导抗病毒蛋白如ZAP和PKR的合成[22]。由于猪流行性腹泻病毒致病机制类似于传染性胃肠炎病毒，所以具有一定的参考意义。施开创等[23]证明了猪流行性腹泻病毒 nsp1蛋白抑制IFN-β激活的JAK/STAT信号通路，所以可以通过益生菌激活与IFN相关的信号通路诱导抗病毒反应，促进其产生IFN-α、IFN-β等抗病毒因子，增强抗猪流行性腹泻病毒活性。在仔猪基础日粮或饮水中添加植物乳杆菌有良好的抗炎活性，能显著提高肠道中sIgA的分泌，促进仔猪空肠和回肠绒毛发育，提高绒毛高度、回肠隐窝深度以及肠道黏膜免疫功能[24]，可能减轻猪流行性腹泻病毒诱导的高水平炎症反应以及肠绒毛萎缩、脱落、空泡化等症状。

4 益生菌抗猪流行性腹泻机制探讨

目前有关益生菌抗猪流行性腹泻的研究有限，由于传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒同科同属，临床症状相似，所以常将两种传染病一起研究。通过一系列对传染性胃肠炎病毒的研究推测益生菌可能是从三大方面来发挥抗猪流行性腹泻病毒的作用。

4.1 益生菌-猪流行性腹泻病毒 益生菌与猪流行性腹泻病毒竞争细胞受体或通过吸附病毒颗粒，阻止猪流行性腹泻病毒的侵入。枯草芽孢杆菌OKB105和表面活性素能够与传染性胃肠炎病毒竞争性结合细胞受体[25]；同时有研究表明，出生到断奶初期仔猪口服肠球菌可明显降低仔猪腹泻率和腹泻程度，并提高仔猪平均日增重。由于传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒是同属冠状病毒且致病机制相似，故益生菌可能与猪流行性腹泻病毒竞争性结合宿主细胞上受体或吸附病毒颗粒，以阻止猪流行性腹泻病毒的侵入。

4.2 益生菌代谢产物-猪流行性腹泻病毒 益生菌代谢物质(如有机酸、胞外多糖)可以减弱病毒效力。猪流行性腹泻病毒在自然环境下的生存能力不强，在高温、低pH、高浓度胰蛋白酶和氯仿的环境下，病毒滴度会下降[26]。植物乳杆菌LPZ菌株能在肠道上定植，快速生长和产生乳酸，从而形成低pH环境，可能会减弱猪流行性腹泻病毒毒力。植物乳杆菌ZN-3菌体或pH 7.0发酵上清液,对细胞无毒副作用,均可在一定程度上降低猪流行性腹泻病毒对宿主细胞的感染活性,可有效用于预防和治疗猪流行性腹泻[27]。研究发现，植物乳杆菌的EPS能够促进信号转导和转录激活因子3(STAT3)与occludin和ZO-1基因的启动子结合，促进肠道紧密连接蛋白的表达，从而增强肠道屏障功能[28]。另外，本课题组前期研究发现，植物乳杆菌LP-1产生的EPS可抑制猪流行性腹泻病毒感染诱发的炎症反应。同时，在体外细胞试验发现了EPS可促进肿瘤坏死因子-α(TNF-α)高水平分泌，其是凋亡的启动因子，诱导猪流行性腹泻病毒感染后细胞的凋亡。

猪流行性腹泻病毒 S1亚基NTD和CTD结构域有可能结合不同的受体，特别是碳水化合物或跨膜蛋白[6]，而益生菌本身会产生淀粉酶、蛋白酶、多聚糖酶等碳水化合物分解酶,可降解宿主靶细胞上猪流行性腹泻病毒相应受体，是否能阻止猪流行性腹泻病毒入侵还有待进一步研究。

4.3 益生菌-机体 益生菌刺激机体诱发免疫应答反应及抑制炎症因子的表达。研究提出，植物乳杆菌可缓解由于致病菌侵袭造成的仔猪肠道紧密连接蛋白claudin-1、occludin和ZO-1含量的降低，提高紧密连接蛋白occludin、ZO-1的mRNA表达以及β-防御素2、3(pBD2,pBD3)的含量，抑制促炎性细胞因子IL-6和IL-8等的表达，增强仔猪肠道上皮的防御功能。同时，植物乳杆菌IS-10506能够通过提高ERK和β-连环蛋白的表达来激活肠道干细胞的分化，抵抗肠道炎症，维持肠道健康，进而预防猪流行性腹泻[29]。

5 益生菌在猪流行性腹泻上的应用

益生菌在临床上常用作动物饲料添加剂、微生态制剂和疫苗接种的一种新替代方法。并且将益生菌联合应用也在临床上取得了显著效果。猪流行性腹泻病毒感染引起仔猪营养不良导致肠道菌群(GM)从门到属甚至物种水平的失衡和移位。如猪流行性腹泻病毒感染的仔猪中魏氏梭菌(引起肠发炎)数量显著增加，而有益细菌(例如产生短链脂肪酸、丁酸盐的细菌)减少。另外，猪流行性腹泻病毒感染还改变了仔猪肠道中的优势细菌。研究表明，普氏杆菌、拟杆菌和副球菌是产生短链脂肪酸的细菌，丁酸梭菌是产生丁酸盐的细菌[30]。因此，这些细菌比例的降低可能导致肠道微生物群不稳定，并可能促进猪流行性腹泻病毒的感染，这说明了肠道菌群(GM)的改变会促进猪流行性腹泻病毒的感染。因此，肠道菌群在抵抗病毒感染引起的胃肠道传染病方面起着重要的作用。目前，不同植物乳杆菌菌株已经大量应用于抗病毒研究中。口服灭活的乳酸杆菌L-137(HK-LP)，可激活先天性免疫并增强其诱导的I型干扰素(IFN-β)表达水平，从而提高其抗禽流感病毒H1N1的能力；植物乳杆菌LRCC5310产生的EPS通过抑制TNF-α的分泌和活性来抵抗轮状病毒。

5.1 地衣芽孢杆菌 Peng等发现，地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂，具有明显的抗猪流行性腹泻的作用，地衣芽孢杆菌粗提物(BLFP)中的表面活性素样肽具有抗猪流行性腹泻病毒的作用。与对照组相比，试验组猪流行性腹泻症状有所减轻，细胞外病毒RNA水平显著降低，肠绒毛脱落和病毒数量也有所减少，并且确定了BLFP在一定剂量下对常规猪是安全且无毒副作用的[31]。

5.2 活乳酸菌 泰国使用乳酸菌上清液(LAB-CFS)预处理Vero细胞，针对猪流行性腹泻病毒大流行株进行抗病毒活性试验。Wandee等发现，将乳酸菌的CFS稀释度控制在1∶16的情况下，不仅可以降低细胞病变效应(CPE)，还对Vero细胞没有细胞毒性，能够明显降低猪流行性腹泻病毒活性。但LAB-CFS抗猪流行性腹泻病毒的作用机制尚不清楚，还有待进一步研究。猜测可能是LAB-CFS中代谢物阻止猪流行性腹泻病毒吸附侵入细胞[32]。

5.3 肠膜明串珠菌 Chang-Liao等从开菲尔谷物中分离出4种乳酸菌(LAB)，即杜兰肠球菌、肠膜明串珠菌、牛乳杆菌、乳酸乳球菌，其中肠膜明串珠菌的细胞内提取物Ln在感染猪流行性腹泻的Vero细胞中对猪流行性腹泻病毒的预防作用更强，并且还具有对猪流行性腹泻病毒的体外治疗作用和体外直接抑制作用。肠膜明串珠菌不是简单地通过益生菌与病毒的直接相互作用抑制病毒吸附和渗透到细胞中，而是通过显著上调Vero细胞中黏液病毒抗性蛋白1(MX1)和干扰素刺激基因15 kDa蛋白(ISG15)表达，从而达到抗病毒作用[33]。但其是否还通过其他机制产生抗病毒作用目前尚不明确。

5.4 植物乳杆菌 Huang等发现，植物乳杆菌NC8更适合用作表达保护性抗原的黏膜递送穿梭载体，所以他们将猪流行性腹泻病毒的免疫原性S蛋白和诱导的DCpep构建了融合蛋白，并在植物乳杆菌表面表达了该蛋白，获得纯化的重组NC8-pSIP409-pgsA’-S-DCpep在小鼠身上可以特异性结合树突状细胞靶向肽并触发细胞和体液免疫反应。重组NC8-pSIP409-pgsA’-S-DCpep可以明显增强IgG和IgA的分泌，产生针对S蛋白的特异性抗体，其诱导的全身免疫应答具有良好的猪流行性腹泻病毒中和活性[34]。重组植物乳杆菌可能有助于开发针对猪流行性腹泻病毒攻击的新型疫苗。

6 展望

猪流行性腹泻是猪养殖业中影响严重的传染病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失。猪流行性腹泻病毒基因型突变，导致传统意义上的疫苗在很大程度上失去了保护作用，所以如何在基因型变异的基础上研究出新方法来防治该病，成了人们研究的热点。研究发现，大部分益生菌不仅可以减少有害菌的定植，还有抗病毒作用，如果能借助现代先进的研究技术，根据益生菌的不同抗病毒机制对益生菌加以广泛利用，将会带来不可估量的经济效益。临床上需要筛选抗病毒能力强、安全性好、黏附程度高的益生菌来防治猪流行性腹泻，减少猪养殖业的经济损失。但是益生菌效果不是很稳定，其次益生菌起作用必需要有相当数量的活菌，才能保证效果。而且益生菌应用还需要精确到菌株，仅通过属或种鉴定益生菌是不够的。所以，新型、有效且稳定的新型菌株是需要不断发现的。目前，多数研究借助益生菌菌株(如植物乳杆菌、酵母菌)作为载体来研究抗猪流行性腹泻病毒感染，具有很大的研究开发前景。在人体临床干预研究中发现，特定的益生菌菌株可以缩短病程或降低某些病毒感染的风险；动物临床上发现，益生菌和(或)其产物与传统抗病毒药物的组合物具有协同作用，在预防和治疗某些病毒感染方面也有显著的效果；并且益生菌在一定的稀释浓度下还可以提高抗病毒感染性，并且对细胞无毒性。但益生菌抗猪流行性腹泻的具体机制尚不完全清楚，所以有待进一步研究。相信随着对益生菌的研究越来越深入，益生菌会为抗猪流行性腹泻或防治其他动物疫病做出更大的贡献。