毛坤明

(福建省福清市畜牧兽医中心，福建 福清 350300)

鸟类的胚胎发育完全都在蛋壳内完成，胚胎发育过程中，胚胎外组织的羊膜、浆膜、尿囊膜发生了急剧的组织形态学变化，以适应不同发育阶段胚胎的变化和营养物质吸收进入胚体。胚胎外组织的形态学变化过程相对恒定，并且对应于胚胎正常发育的特定阶段，对应于其在蛋壳的特定分布区域。这个特性被利用于鸡鸭鹅等家禽的人工孵化作业中，在孵化的特定时间点通过“照蛋(Candling)”的工序，观察胚蛋表面的血管分布以及胚胎投影变化和内容物透光情况，以了解胚胎发育情况[1-2]。同时，禽类胚胎是发生学研究比较热门的材料，尤其胚体外的绒毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane，CAM)血管网，经常被作为研究对象[3-4]。在使用禽类胚胎的相关研究中，除最常用的鸡胚外，日本鹌鹑也被大量研究人员所关注。对于日本鹌鹑的胚胎发育特征，已有一些研究做过描述。Padgett和Ivey(1960年)[5]描述了孵化每24 h节点时的鹑胚发育特征，并测量了胚胎完全伸展时的胚长、腿翅长度等数据。Ruffins等(2007年)[6]使用高分辨率核磁共振成像技术，再现了孵化第5～10胚日时日本鹌鹑胚胎在蛋壳内的形态特征。Ruparelia等(2014年)[7]使用光学投影断层扫描技术生成、建立了孵化1～15日龄的鹑胚3D模型图谱门户。Ainsworth等(2010年)[8]依据Hamburger和Hamilton(1951年)[9]所描述的鸡胚发育的主要特征，也把日本鹌鹑胚胎发育相对应划分成46个时期，并与鸡胚相应特征的出现时间做了比较，同时还关注特定阶段的羽毛色素沉积模式以及喙和第3脚趾的长度，来共同界定胚胎发育的时间。国内张信文等(2002年)[10]报道了法国肉鹌鹑胚胎发育的形态学观察。但是这些研究基本上都只关注胚胎本身的形态，而对于胚体外组织的形态变化没有涉及。

普通日本鹌鹑蛋表面有不规则的色素沉积，难以实施“照蛋”工序以观察孵化过程中其胚胎外组织在蛋壳上投影的变化，故未见有相关文献报道。本试验使用日本鹌鹑白壳蛋，在孵化中每天实施“照蛋”作业，观察胚体外组织在蛋壳上的发展、分布变化，并解剖发育中胚蛋，观察卵黄、卵白、胚胎和胚体外组织相对应的形态特征变化。

1 材料与方法

试验用日本鹌鹑为日本国立岐阜大学农学部动物遗传研究室所有，笼养于实验禽养殖房，每笼养殖1公4母，每天给予16 h光照。给饲产蛋鹑专用饲料，自由采食和饮水。每天中午12：00取当天产受精蛋，在39 ℃、60%湿度条件下孵育，钝端朝上倾斜45°，每2 h自动翻蛋1次(对侧倾斜45°)。

每日12：00取出相应孵化日龄的白壳胚蛋，在黑暗环境中，使用LED白光手电筒快速完成透照并拍照，然后放回孵化机继续孵化。透照时，0～3胚日从蛋对侧给光，4胚日以后为了拍照清晰，另在钝端补光。同时取出解剖的各日龄胚蛋，置于平皿中解剖，2 h内完成观察。早期胚胎或某个关键细微位点使用解剖显微镜观察，连接数码相机拍照，较大胚胎直接用数码相机拍照。拍照时平皿底部垫上直尺，以显示拍摄对象的相对大小。

图片使用Photoshop处理，根据直尺标定各个胚胎的相对大小。1～12胚日的形态学描述基于各1 000枚 以上鹌鹑胚蛋的解剖观察，0胚日及13～15胚日的形态观察以及照蛋各使用了5～10个样本。为了更好理解并能与鸡胚相比较，各鹑胚日龄后附有对应的鸡胚日龄数据参考Padgett和Ivey(1960年)[5]。

2 结果

0胚日(入孵前) 照蛋：除锐端稍微透亮外，其他区域呈均匀蛋黄色轮廓(图1,0 d)。解剖：卵白完整包绕着卵黄。卵黄最上面白色圆盘状区域为胚盘(图2,0 d)。

1胚日(入孵24 h后) 照蛋：蛋钝端浮现1个圆形血岛，如同红日，周围亦被其染红(图1,1 d)。解剖：胚盘分化发育，黄豆大，突起于卵黄表面，为蛋黄胚胎区。由于还未形成完整卵黄循环，在透照时看到的红色血岛区域，解剖后观察反倒不易看到红色(图2,1 d)。

2胚日(相当50～55 h鸡胚) 照蛋：胚胎和血管组合成红色“蚊虫”外观。卵黄投影靠近钝端，血管网外缘围成的樱桃形或圆形轮廓，约占卵黄投影1/2，轮廓内部还有1个由血管边缘围成的两端大小不同的8字型轮廓，大端是胚胎的头端，可见心脏在其中跳动(图1,2 d)。解剖：卵黄循环形成。胚胎长条状，藏于卵黄的凹陷内。头部扭转、屈曲弯向胸侧，抵近心脏。心脏扭曲管状，节律性快速泵动。胚中段两侧有脐肠间动、静脉延伸分布于卵黄囊，血管网向前后成放射状分布，毛细血管在边缘汇合成缘窦，缘窦围成“樱桃形”轮廓(图2,2 d)。

3胚日(相当3～4 d鸡胚) 照蛋：血管清晰，放射状分布，与胚胎的心脏投影组合成“蜘蛛”外形。卵黄投影增大，血管区占卵黄投影的2/3以上。可见1个V字形无血管区(图1,3 d)。转动胚蛋，胚胎及血管区域仍易游移。解剖：卵黄囊血管分布卵黄膜表面约1/3区域。卵黄囊血管向胚尾端生长的，开张幅度小，位于浅表，可见交织吻合在一起；而向头端延伸的，开张范围较大，且卵黄囊深陷，胚前端仅在边沿见少量血管交织相连，故照蛋时呈V字形(图2,3 d)。尿囊初现，呈球状血管网，直径约2 mm，比脑泡(头突)略小；羊膜闭合成羊膜囊，包容胚体；上颌突变得明显；眼睛仍无色素；胚体前部在心脏处向内弯曲，小于90°，而胚胎后半部仅略微弯曲，但尾芽180°内折，尾尖部抵向尿囊根部；四肢原基出现，翼芽的宽大于长，腿芽的长宽相近(图3,3 d)。

4胚日(相当4.5～5 d鸡胚) 照蛋：卵黄投影扩展到蛋的约下1/3界。血管网清晰，呈栅栏状，占据蛋的中上大部分区域，但未完全覆盖卵黄投影。在“血管栅栏网”的映衬下，4～6 d V字形缺口更明显。此日开始，蛋转动时，卵黄囊血管位移极慢，因其开始紧贴内壳膜。钝端接近气室位置，有小区域变得明亮，是因羊水和尿囊液增多，此处透明度增加。晃动胚蛋，此处可见胚影或者黑色眼点闪现，俗称“单珠”(图1，4 d)。解剖：卵黄囊血管发展迅速，约占卵黄囊1/2表面，毛细血管微小，而主干血管走向清晰，“树枝状血管栅栏”外观明显。鲜红的静脉较粗，暗红的动脉较细，易辨认。尿囊与羊膜囊近乎等大(图2，4 d)。胚胎呈C字形，末端小尾芽内构，与两侧腿芽端部相邻。胸腔未完全封闭，可见心脏突出于胸前。腿芽长大于宽，但其长度未超越尾尖。头部脑包最明显突起的是中脑。端脑两叶突出，间脑消退。眼睛开始显现色素(图3,4 d)。

图1 鹌鹑蛋孵化每间隔24 h的照蛋特征Fig.1 Candling quail eggs at 24 h intervals of incubation0 d～15 d：0～15日龄；下图同。0～3 d：对侧给光； 4～15 d：对侧和钝端双光源0 d-15 d：0-15 day-old; the same as below. 0-3 d：Opposite light； 4-15 d：Lights from opposite side and blunt end

5胚日(相当6～6.5 d鸡胚) 照蛋：上部明亮的尿囊区域迅速扩大，约占蛋1/6高度，较粗的尿囊膜血管紧贴于内壳膜，清晰可见。卵黄囊“血管栅栏”占据了蛋中部1/3以上，已完全覆盖卵黄投影，由于上部尿囊挤压，其上端下移，“血管栅栏”高度收窄，且开始变得有些模糊或整体呈红布带样(图1,5 d)。解剖：卵黄囊血管延伸占据约3/5表面，毛细血管增粗、增多，主干血管弯曲增多，外观呈树状分布特点。4～5 d卵黄囊体积膨胀至最大，之后渐缩小。浆膜从卵黄囊膜分离、游离的面积最大，且剩余与卵黄囊未分离的部分也极易剥离。尿囊生长显著超过羊膜囊约3～4倍，游离于羊浆膜腔，包绕覆盖羊膜囊，并与浆膜接触融合形成CAM。尿囊血管增粗，分布稀疏，大部分四级分叉后以毛细血管相连(图2，5 d)。中脑仍然非常大，其2个脑叶突出。端脑很大，但其双叶状态不如4 d时明显。喙原基出现，尖端隐现白点。胚胎胸腹腔完全封闭，但透明，仍隐约可见心脏、肝、肌胃等内脏。肘关节和膝关节明显，肢端的3个指/趾分叉的轮廓也可分辨，腿的末端与尾尖平齐。胚胎增厚，尾芽呈背侧弯曲而腹侧平直的状态(图3，5 d)。

图2 孵化各日龄胚蛋解剖后的外观Fig.2 Appearance of embryo eggs after dissection at each day of incubation

6胚日(相当7.5 d鸡胚) 照蛋：上部明亮尿囊区约占2/5高度，血管更粗更清晰，还能明显看到分化的三级、四级血管，此后可以明显看到一级血管随着胚胎活动而晃动，胎儿在羊水中沉浮，时隐时现。尿囊生长延伸入浆膜和卵黄囊之间，可见CAM刚越过卵黄投影，开始接触包绕卵白。CAM血管和卵黄囊血管重叠，因此，可见中部卵黄囊投影区“模糊血管栅栏”或“红布带”外观，高度再收窄，约占1/5(图1,6 d)。解剖：尿囊膜伸展，使浆膜从卵黄囊分离，并与浆膜粘合成CAM，包裹了卵黄囊，但还未完全越过卵黄囊。CAM血管层次清晰，见表面明显的鲜红色粗静脉和暗红色细动脉，进一步分化更多细血管，动静脉间毛细管相连(图2,6 d)。卵黄囊体积缩小，呈扁南瓜状，血管延伸表面4/5区域，但卵黄囊血管区中心地带，即上述V字形缺口，无血管区域显著扩张，“南瓜”边沿较多血管分布。移除压迫的羊膜囊，“南瓜”柄部区域显著突出，而边沿呈轻微皱缩状态(图4A)。胚胎和5 d时相似，C字形，头和身体近乎同大，哑铃状，但整体增大。中脑微突出于脑胞。卵齿较明显。翅3指和脚4趾分界明显。腿长1/3超出尾尖。尾巴短而钝(图3,6 d)。

图3 孵化各日龄鹑胚的形态外观Fig.3 Morphological appearance of quail embryos at each day of incubation3 d～6 d:3～6日龄，图像放大3倍,比例尺=5 mm; 7 d～15 d:7～15日龄，比例尺=15 mm3 d-6 d:3-6 day-old，the image was magnified 3 times,scale bar=5 mm; 7 d-15 d:7-15 day-old，scale bar=15 mm

图4 6胚日(A)和10胚日(B)的卵黄和卵白Fig.4 Yolk and white at day 6 (A) and day 10 (B) of incubation

7胚日(相当8～9 d鸡胚) 照蛋：CAM生长全面越过卵黄囊血管区，大部包绕了蛋白，快接近蛋小端，准备吻合；CAM左右侧前缘在胚蛋背面汇合成倒V字形状，对应位于浆尿囊膜二级血管分叉的下方。不易见到胚胎。卵黄囊可以晃动，故改变体位，其投影会稍微改变，但还不能转动(图1,7 d)。解剖：CAM毛细血管网更丰富，复杂。CAM主静脉一边(鲜红粗血管)折向胚胎背侧，动脉一边向胚胎腹侧伸展，CAM从胚胎腹、背、头、尾侧一起向蛋的锐端延伸，腹侧伸展最快，牵引向锐端，背侧最慢，所以照蛋时头尾侧尿囊边沿在锐端背侧形成倒V字型。卵黄囊有部分还紧贴于蛋壳膜，故照蛋时可以晃动而不能转动。卵黄水分大量减少，卵黄囊皱缩成扁南瓜状，边沿皱褶加大，卵黄囊无血管区仅剩与卵白相邻的直径大约8 mm的区域，血管开始退化缩减(图2,7 d)。胚胎鸟状外观基本形成。中脑不再突出。眼睛是头部最突出的结构，占头部总面积的一半以上。眼睑的周长略呈椭圆形，覆盖眼睛的一部分。眼前角瞬膜出现。在虹膜周围，14个巩膜乳头形成完整圆圈。耳道非常明显。四肢大大加长，关节的弯曲均已完成，腿长的1/2超过尾尖。臂背到尾巴的背面开始有羽芽萌出迹象，腿根部红色毛囊明显可见。肝、胃、肠具雏形。胆囊还未见绿色胆汁(图3,7 d)。

8胚日(相当10～11 d鸡胚) 照蛋：上部清亮的尿囊区域还在扩大。CAM在锐端吻合，与蛋壳膜内侧完全紧贴，蛋白被完全包绕。CAM血管网完整覆盖壳膜内面。此时卵黄囊也可以随胚胎转动，胚胎在大范围内泳动，不时见胚胎的黑影闪动，尿囊一级血管明显随胚胎大范围摆动(图1,8 d)。解剖：CAM在蛋的小端合拢，包绕所有壳膜内的内容物。胚胎、卵黄、卵白从上到下层叠。卵黄囊血管多枯萎，血管遗迹处的卵黄囊呈现金黄色，与整体的黄颜色明显区别(图2,8 d)。喙突出，破壳齿较大。眼睛更加突出。眼睑开始长满眼球表面，椭圆形，下眼睑向上生长，较上眼睑平直。眼观最明显的是，黑和棕色羽芽初现。在脑后颈部两侧起向后延伸尾部、腰髂部背脊两边，前胸，翅根部、中翼和腿根等处的后缘，最早冒出羽芽。尾羽最长。露在脐外的小肠和连接卵黄囊的卵黄柄内开始见到绿色胆汁，9 d仍可见。胆囊充盈胆汁(图3,8 d)。

9胚日(相当12 d鸡胚) 照蛋：上部尿囊明亮区域开始减小。胚胎黑影和黑色单眼或双眼频频闪现。底部卵白一侧被尿囊包裹提拉越过卵黄囊，抵近上部的尿囊清亮近透明区域，从胚蛋侧面观察，卵黄囊(黄红色)投影近乎楔形插于蛋的中间。卵黄囊由于已经被尿囊完全包裹而游离，反倒可以随着胚胎的运动而游移，随着胚蛋体位变化而发生一定程度的倾斜。8 d之前胚胎基本保持垂直于蛋的长轴的体位，9 d以后开始变换体位(图1，9 d)。解剖：CAM循环已经完整，正面可以看见上行分支的暗红动脉和下行分支的鲜红静脉，卵黄囊区位置的尿囊血管多数呈垂直于大血管互生的小树样或长羽毛样外观。背侧卵白囊的一端越过卵黄囊，接触羊膜，浆羊膜道初形成，少量卵白已经进入羊膜腔。剥离蛋壳膜时，CAM表面开始出现明显出血，即毛细血管已伸入蛋壳内膜纤维中(图2，9 d)。喙更加突出，下喙先端也见白色角质化，白色区域逐日扩大，到11 d最大，12 d开始变褐色。眼睑椭圆形半闭，眼睛显得略小；眼周见白色毛囊隆起。先前长出的羽芽黑色或棕色色素分明，翅根、中翅后沿、腿根部羽毛长可覆盖相应局部皮肤，头部、颈部下方、耳廓前、眼眶下、翅背、腿背等处均冒出黑或褐色羽芽，头部羽芽排列如同稀疏的“秧苗”(图3，9 d)。

10胚日(相当12～13 d鸡胚) 照蛋：尿囊明亮区继续缩小。卵白囊被拉向羊膜，旋转胚蛋可见卵黄囊和卵白呈互相嵌合。胚蛋中间，胚胎和卵黄的投影显著扩大(图1，10 d)。解剖：蛋壳与壳膜之间(剥离时感觉明显)湿润；CAM毛细血管更丰富，剥离壳膜出血点更密集(图2，10 d)。羊膜腔多量稀卵白进入，剪破见明显蛋白样液体流出。卵黄囊血管极少，皱缩成“金元宝”状，与横卧的胚胎相拥，卵白囊垫于二者斜下方；卵白浓缩成圆馒头状凝块，体积约为卵黄的1/3(图4B)。眼睑继续生长，上下缩窄成新月形。除颈部两侧的小脊外，身体表面均长出羽毛。背面和侧面羽毛棕和黑色，腹侧的为白色或银色。脚趾先端开始现白色角质化(图3，10 d)。

11胚日(相当13～14 d鸡胚) 照蛋：中部胚胎和卵黄的黑影范围继续向大小端方向扩张。锐端卵白囊透光区缩小，仅半边可见透明，不时见胚的尾部闪现(图1，10 d)。解剖：在剥离壳膜时，CAM即出血，且感觉不易剥离，即血管侵入壳膜结合更紧密。尿囊腔内见少量白色尿酸盐沉淀，此后一直到15 d，尿酸盐日增。卵白囊显著减小，羊膜腔内可见蛋白团块。眼睑羽毛明显，开口近乎闭合(图3，11 d)。10 d之后，肢体结构没有重大变化，只是大小变大，羽毛增长、增多。腿鳞片开始出现，逐日生长，明显，重叠。除腿和喙，胚胎覆盖各色羽毛。此后鹑胚羽毛增长变密，胚体无大的变化。

12胚日(相当15～16 d鸡胚) 照蛋：黑影区域增大。尿囊血管的可见区域继续变小。蛋锐端仅剩些微透光区域(图1，12 d)。解剖：蛋壳与外壳膜结合区最为湿润，蛋壳乳头层如黏稠浆泥样。外、内壳膜之间，比内壳膜与CAM之间更易于剥离，剥离外壳膜时，内壳膜表面仅见一些点在出血，但剥离内壳膜时，CAM表面密集出血(图5A)。羊膜腔与羊浆膜道内残存少量絮状卵白。

13胚日(相当17 d鸡胚) 照蛋：锐端看不到光亮。因鹑胚变位下沉，上方尿囊血管明亮区反而变大(图1，13 d)。解剖：气室内膜凹凸不平，可见起伏运动。蛋壳乳头层与外膜间水分明显减少。壳内、外膜易分离。此日后壳内膜与CAM逐日更易剥离，CAM表面仅见少量自限性出血(图2，13 d)。卵黄囊团块又开始变得松软。

14胚日(相当17～18 d鸡胚) 照蛋：黑影上端凹凸不平，明显起伏变动(图1，14 d)。解剖：CAM表面仅在与卵黄囊重叠区域，有少量出血点。羊膜与羊浆膜道的接口还在，为膜性栅网状，羊膜腔剪破不再见蛋白样液体扩散。小肠收进腹腔，牵扯卵黄囊紧贴于脐部，准备进入腹腔(图2，14 d)。

15胚日(相当18～20 d鸡胚) 照蛋：黑影再向钝端扩张，气室向一侧倾斜，低侧下缘可见CAM血管，其他黑色不透光。最特征的是喙窜破内膜伸入气室，气室下缘蛋壳或已被喙顶破出现裂纹(图1，15 d)。解剖：喙窜破内壳膜伸入气室空间。CAM血管退化剩少量；羊膜极薄(图2，15 d)。蛋壳膜水分骤减，柔软如纸张，剥离壳外膜后，壳内膜显示纯白色(图5B)，而此前由于有水分湿润而显近乎透明无色(图5A)。尿囊腔还有少量尿液，白色尿酸盐成片。卵黄已完全收入腹腔(图3，15 d)。

图5 孵化后期分层剥离蛋壳内、外膜时的状态Fig.5 Shows eggshell,outer membrane and inner membrane separable each otherA：12日龄; B：15日龄A:12 day-old; B:15 day-old

16胚日(相当21 d鸡雏) 出壳。壳内残留尿酸盐及尿囊血管遗存。

3 讨论

本试验展示了孵化中鹑胚及其胚体外组织发生、发展的形态和相对体位以及卵黄、卵白、蛋壳、壳膜的变化过程。

日本鹌鹑受精蛋孵化2 d，鹑胚呈长条形，心脏原基形成并搏动，开始血液循环；3 d羊膜闭合成囊包围胚胎，胚腿翅原基出现，5 d胸腹腔封闭，3～6 d头和躯干两部分近乎等大同步渐增，呈C字形状；7 d胚胎体躯腿翅伸长，鸟形初现，体表羽芽萌出，以后羽毛逐渐增多生长变密，并且躯体的生长快速超过头颈部，后半期外观主要是体躯增大，腿、爪、喙、羽毛等生长，变硬、变长、变大。

孵化中，卵黄囊体积逐日增大，4～5 d时达最大，以后渐小，15 d卵黄囊完全收入鹑胚腹腔。卵黄囊血管网2 d初现，如“蚊虫”，浮游在蛋黄的顶面，因其还未粘附于蛋壳膜内侧面，血管观感模糊；4～5 d最发达，在5 d以后尿囊生长楔入隔断，血管逐渐开始枯萎、减少。

尿囊在3 d初现，为球形血管网，比头泡略小。4 d约与羊膜囊同大。5 d开始与浆膜融合为CAM且生长楔入卵黄囊和壳内膜之间，逐步取代卵黄囊血管网，与蛋壳外膜直接接触，行使“呼吸”功能。6 d生长越过卵黄囊血管网。7 d到达蛋的锐端。8 d在锐端闭合，完整包绕了蛋壳膜之内的胚胎、卵黄囊以及卵白囊。剥去蛋壳膜时，CAM血管9 d开始出现少量小出血点，以后逐日出血面增加，12 d时出血量达到高峰；这期间，蛋壳乳头层水分渐增，12 d时水分最多，软化成黏稠浆泥样，说明9～12 d期间CAM毛细血管生长伸入蛋壳内膜，水分渗透进入乳头层，从而使输送矿物质成为可能，胚胎才能吸收钙等矿物质，为胚胎骨骼发育提供营养物质。13 d CAM血管开始逐渐枯萎，壳膜及乳头层水分明显减少，以后逐渐退出与壳膜的紧密连接。11 d尿囊腔中析出白色尿酸盐，以后量逐日增加。

卵白量逐日减少，水分转移进入卵黄囊[2]；8 d时被CAM包裹时形成的卵白囊包容，9 d可见卵白囊与羊膜间形成羊浆膜通道，卵白由此通道快速进入羊膜腔，供胚胎吞饮。

8 d胆囊绿色胆汁充盈，流到露在腹腔外的小肠以及卵黄柄的管道中，通向卵黄囊。此时胆汁可能开始参与了卵黄内营养成分的消化。

禽蛋壳和壳膜不但共同组成蛋的坚固的保护结构，也为胚胎后期发育提供主要的矿物质来源[11-12]。蛋壳及壳膜的营养物质吸收进入胚胎，其结构解离、致弱，使胚胎容易破壳而出。这个过程，水分的参与必不可少。紧贴蛋壳膜内侧有个界限膜(Limiting membrane)，为匀质、致密组织层，被认为是蛋保持水分的最主要结构,Yoshizaki和Saito(2002年)[13]发现，孵化中鹑胚蛋的界限膜逐日变薄，10 d达最薄，之后基本不变，而在8～12 d间壳膜的水分透过明显逐日加快，之后稳定。本课题组之前研究[14]发现，孵化5～10 d的鹑胚浆膜分泌一种蛋白酶，分解了界限膜，使之逐日变薄，让水分得以较自由出入蛋壳膜和蛋壳乳头层间的空间。这些发现与本试验观察到的12 d时蛋壳与壳膜接触的乳头层因含水分多而呈现石灰泥样的现象基本吻合。另一研究[15]显示，蛋壳内、外膜相邻的纤维并不完全平整，而是有一些互相纠缠扭结在一起，并在扭结处旁边形成小空洞，同时内外膜之间有多糖等成分填充的介在层黏结，这些结构使得内、外膜强力纠结、粘合在一起，不容易分离，加强了壳和膜整体的抗压能力，以保护蛋内容物及胚胎。孵化后期水分侵入蛋壳膜及壳、膜连接的乳头层，溶解了其中多糖等可溶性基质成分，软化了壳膜纤维，原先扭结的纤维得以解离，同时溶解吸收了乳头层的基质及钙等矿物质，因此，内、外壳膜之间以及壳与膜之间得以容易分离。这些变化使得蛋壳除气室之外区域变得易碎，有助于雏鹑自行顶破蛋壳而孵出。

志谢：本试验在日本国立岐阜大学完成。伊藤慎一教授、吉崎范夫教授提供鹌鹑蛋和试验条件。并以此文纪念吉崎范夫教授。