叶迪，施江，高双成，王占营，史国安✉

1河南科技大学牡丹学院/洛阳市牡丹生物学重点实验室，河南洛阳 471023；2洛阳农林科学院牡丹研究所，河南洛阳 471000

0 引言

【研究意义】牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）鲜切花是国内外切花市场的高档花材，极具市场发展前景。通常切花观赏的核心是花朵，但花瓣衰老脱落在很大程度上决定着一朵花的观赏价值和经济价值的高低，对花卉业至关重要[1-5]。牡丹切花离开母体后衰老加快，开放时间明显缩短，观赏品质受到严重影响，制约了牡丹切花产业的发展[6]，深入开展牡丹切花保鲜理论与技术研究具有重要意义。【前人研究进展】‘洛阳红’是乙烯敏感型花卉，瓶插期间出现明显的乙烯跃变现象[6-9]。牡丹花朵开放和衰老脱落受到多方面因素的调控，包括温度、外源糖、乙烯及其作用抑制剂等[8-15]，萎蔫和落瓣是其主要衰老特征。器官脱落是高等植物生命周期中一个重要的发育事件[16]，包括衰老叶片、幼蕾、幼铃、成熟果实、成熟种子，以及花朵和部分花器官的脱落等[17-18]。器官脱落是调节植物体内有机营养物质和矿物质的合理转运与再分配的重要过程[19]，花瓣脱落也属于正常脱落现象之一[20]。植物器官发生脱落的区域称为离区或离层（absciss zone，AZ），由几层小而细胞质密集的细胞组成，细胞之间缺乏大的空泡和成熟特征[21]，类似于未分化细胞[22]。不同植物类型、不同器官与组织中花瓣离层细胞层数存在一定差异，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）花瓣的离层细胞有 4—6层[16]，水稻离层细胞有 12层[23]。植物花瓣或花被离层部位一般在花瓣基部与花托相连，当花瓣开启衰老进程时，激活相关代谢过程，开始释放水解酶类，离层细胞壁降解，进而离层细胞发生解体，最终导致花瓣脱落[19,24]。乙烯和生长素共同控制着植物离层细胞的解体过程[25-26]。生物体内重要的发育过程都有生长素参与，依赖Trp的TAA/YUC合成途径将Trp转化为IAA，调控植物的生长发育[27]。生长素梯度学说指出，离层的生长素梯度变化能启动脱落，乙烯能够加速这一过程[17,28]。在许多不同的物种（拟南芥、番茄）和器官（叶片、花瓣、花朵和果实等）中，乙烯加速离层的形成，促进器官脱落[25,29]。外源施用乙烯或乙烯利能促进植物器官的脱落，外源乙烯处理加快石斛兰和玫瑰花朵脱落[30-31]。在月季切花衰老过程中，生长素含量逐渐降低，而高含量生长素能抑制器官脱落[25]，生长素的转运调控了蔗糖向花瓣的运输，延缓了乙烯诱导的花瓣脱落[32]。【本研究切入点】关于牡丹切花花瓣衰老脱落机制研究的报道尚少。基于前期研究，推测牡丹花朵开放和衰老中呼吸跃变受到乙烯和生长素的共同调控，其中伴随着离层水解酶类活性升高以及相关基因表达变化。【拟解决的关键问题】本研究用乙烯拮抗剂（AVB）预处理，结合乙烯释放剂乙烯利（CEPA）预处理，观测牡丹‘洛阳红’切花瓶插过程中花瓣脱落的生理效应，以期为牡丹切花保鲜技术研究提供理论支持。

1 材料与方法

试验于2019年在河南科技大学洛阳市牡丹生物学重点实验室进行。

1.1 试材及取样

供试材料为‘洛阳红’牡丹，于2019年4月14日取自牡丹实验基地，采取开放程度二级（绽口期）的牡丹花枝，采后放入置有冰袋的泡沫箱中，保湿并快速运回实验室。选取生长状态一致的切花，在水中剪切花枝至25 cm，保留2—3片复叶。

将花枝随机分为4组，每组40枝。4个处理包括：对照组用去离子水预处理1 h（CK）；20 µL·L-1乙烯拮抗剂可利鲜（商用乙烯拮抗剂，荷兰可利鲜公司产品）预处理1 h（AVB）；20 µL· L-1外源乙烯释放剂乙烯利（40%CEPA，江苏安邦电化有限公司）预处理1 h（CEPA）；AVB预处理1 h，接着再用CEPA预处理1 h（AVB+CEPA）。预处理结束后，用去离子水单枝瓶插。观察花枝形态和瓶插寿命，瓶插过程中测定花瓣生理指标，并采取 1 cm长度的花瓣基部样品，经液氮速冻后保存在-80℃备用。

瓶插环境温度设为 23—25℃，相对湿度在50%—60%，光照12 h/光暗12 h。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 离区细胞形态观察 将切花的花朵整体切下，纵切为两半，徒手撕取带有花托的花瓣，将花瓣上部分切除，留取1 cm带有花托的花瓣基部，在解剖镜下用尖头镊和刀片撕取合适的切片，用70%乙醇固定，5%番红染色，依次用70%、85%和95%乙醇梯度冲洗，再用 0.05%固绿复染色，100%乙醇固色，50%乙醇-50%二甲苯混合溶液透明，100%二甲苯固定，中性树胶封片，在普通光学显微镜下观察拍照，放大倍数为10 倍[33]。

1.2.2 瓶插品质 从瓶插0 d起，每天在同一时间观察统计花朵的开放等级，测量花朵直径，记录花朵的开放和衰老进程。最佳观赏期为半开期到50%花枝进入始衰期的天数；瓶插寿命为瓶插0 d到50%花枝花瓣开始萎蔫落瓣的天数。

1.2.3 花瓣抗脱落力 依据物理力学原理，自制一个测力装置。用脱脂棉包裹花枝后固定到工作台上，用长尾夹夹紧花瓣中部，链接一根光滑的细尼龙绳，绳子另一端穿过两个无阻尼的定滑轮，链接上与长尾夹等质量的小砝码盘，在砝码盘中增加砝码，直至花瓣脱落，记录添加砝码的总质量。在每一次测量中，花枝和砝码盘的高度以及绳子的长度和角度都保持不变。每个时间点测定外、内层花瓣的抗脱落力，每个测定5个重复，并计算测量值的平均值。依据作用力与反作用力相等的原理，统计花瓣抗脱落力的大小。

1.2.4 乙烯释放速率、ACC含量、ACS和ACO活性 参照王哲等[34]的方法，取花瓣基部0.5 cm称量后放入集气瓶中，静置3 h后采用顶空法，抽取5 mL混合气体注入气相色谱仪中，测定乙烯释放速率。试验使用GC-7890Ⅱ气相色谱仪（上海天美）测定，分析检测器为FID检测器，分析条件为进样口温度120℃，Porapak Q 色谱柱，柱长2 m，内径3 mm，柱温45℃，检测口温度140℃，燃气（H2）流速25 mL·min-1，载气（N2）流速 25 mL·min-1，空气流速 250 mL·min-1。

1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane1-carboxylate acid，ACC）含量采用Concepcion[35]的方法测定。

ACS（ACC synthase）活性采用 FERNÁNDEZMACULET和 YANG[36]的方法测定。ACO（ACC oxidase）活性采用KATO和HYODO[37]的方法测定。

1.2.5 生长素（IAA）含量 参考YANG 等[38]的方法，采用酶联免疫吸附分析法（ELISA）检测花瓣基部IAA含量。取0.5 g花瓣基部样品加提取液快速匀浆，4℃冰箱放置4 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液，沉淀中加1 mL提取液，混合均匀，置4℃再提取1 h，离心得上清，合并上清液过C-18固相萃取柱，将过柱后的样品转入5 mL塑料离心管中，氮吹仪吹干，用样品稀释液稀释至1 mL。样品测定按ELISA试剂盒说明书进行，试剂盒由中国农业大学植物生长调控重点实验室提供。

1.2.6 IAAO活性 参考张志良[39]分光光度法改进试验温度和反应条件，测定花瓣基部IAA氧化酶（IAAO）活性。取0.5 g花瓣基部样品加5 mL pH 6.0磷酸缓冲液冰浴匀浆，4 000 r/min离心15 min，上清液即为酶液，试管中加氯化锰1 mL、二氯酚1 mL、IAA标品2 mL、磷酸缓冲液5 mL、酶液1 mL，混合均匀，弱光条件下置于30℃水浴中孵育30 min，吸取混合液2 mL，加入FeCl3和过氯酸混合液，摇匀置于40℃的黑暗处保温30 min，显色后用分光光度计测定A530吸光值。

1.2.7 水解酶类活性 果胶甲酯酶（PME）活性测定参考 LOHANI等[40]的方法；多聚半乳糖醛酸酶（PG）和 β-葡萄糖苷酶（BG）测定参考曹建康[41]等的方法。

1.3 基因表达分析

使用RNAprep Pure Plant Plus Kit（北京天根科技有限公司）提取‘洛阳红’花瓣的总RNA，用Fastking cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根科技有限公司）将 RNA 进行反转录获得 cDNA，选择PsD-GAPDH作为内参基因，测定瓶插过程中PsETR1、PsCTR1、PsEIN3、PsERF1、PsYUCCA10、PsPIN1、PsPME1、PsPG1、PsBG1的相对表达量。荧光实时定量PCR反应在Roche Light Cycle 96 PCR仪上进行。反应体系和反应程序参照 TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）说明书进行。引物（表1）委托华大基因股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences for qRT-PCR

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016软件及SPSS20.0进行数据整理及图表绘制，在显著性检验的基础上采用Duncan多重比较进行显著性分析，显著水平P＜0.05。

2 结果

2.1 花瓣离区形态

‘洛阳红’切花衰老过程中花瓣逐渐萎蔫脱落，从靠近雌蕊的内层花瓣最早开始脱离花托，靠近萼片的外层花瓣最后脱落。图1-A为切花花器官分布情况，图1-B为切花盛开期花瓣和花托的连接状态，图1-C为解剖镜下与花托相连的单片花瓣，图1-D和图1-E为花瓣与花托相连的细胞状态。图1-E为离区放大部分，上半部分为正常花瓣细胞，排列规则紧密，接近离层的部分细胞逐渐变小，下半部分为花托细胞，排列疏松不规则，中间相连的部分为离层细胞，约有 2—5层，部分细胞已经转化为横向排列的细胞，与花瓣和花托的细胞形态明显不同。

2.2 切花形态和瓶插品质变化

CK瓶插1 d后进入盛开期，4 d时花瓣开始萎蔫失水，6 d开始落瓣；与CK相比，AVB处理在2 d时达到盛花期且一直不脱落；CEPA处理在4 d时花瓣逐渐失水萎蔫，且花径较大，5 d开始脱落，至6 d结束瓶插；AVB+CEPA处理在4 d时花瓣逐渐失水萎蔫，但在7 d时才开始脱落（图2）。AVB预处理能明显延缓切花花瓣脱落，CEPA加快花瓣脱落，而 CEPA能够部分抵消 AVB的抗脱落效应，说明乙烯在调控‘洛阳红’花瓣脱落过程中起着重要的生理作用。

由表2可知，牡丹切花在瓶插过程中，CK组的瓶插寿命、最佳观赏期和最大花径分别为（5.9±0.3）d、（4.5±0.5）d和（11.15±2.2）cm。与对照组相比，CEPA预处理瓶插寿命缩短了1.1 d，最佳观赏期缩短了0.4 d，最大花径增大了1.71 cm；AVB预处理最大花径增大了1.04 cm（P＜0.05）；AVB+CEPA组瓶插寿命缩短了0.1 d，最佳观赏期缩短了0.2 d，最大花径增大了1.71 cm，均达到显著水平（P＜0.05）。乙烯拮抗剂 AVB预处理延缓了牡丹切花的衰老进程，而外源乙烯释放剂CEPA则加速花朵开放和衰老，意味着调控乙烯代谢能够有效地调控‘洛阳红’切花的瓶插品质。

表2 牡丹切花瓶插品质变化Table 2 Changes of quality of cut tree peony flowers in vase

2.3 花瓣脱落力学特性

图3所示，‘洛阳红’切花瓶插期间逐渐衰老脱落，外、内层花瓣抗脱落力有明显差异。外层花瓣的抗脱落力整体比内层大，均呈下降趋势。瓶插前期（0—4 d），CK处理和AVB处理抗脱落力下降较缓，4 d后外、内层花瓣的抗脱落力均呈现大幅度下降，但AVB抗脱落力显著高于CK，仅萎蔫、不脱落；CEPA瓶插期间外、内层花瓣抗脱落力持续下降，始终低于其他处理，4 d时外层和内层抗脱落力分别比CK降低了55.1%和56.1%（P＜0.05），5 d即出现脱落现象；AVB+CEPA处理外层花瓣抗脱落力变化趋势与CEPA处理类似，至5 d时接近CK，而内层抗脱落力变化在前3 d与CK接近，4 d才迅速下降，说明瓶插前期AVB与CEPA有一定的拮抗作用。表明‘洛阳红’花瓣的抗脱落力能够作为花朵衰老脱落特征的重要指标，AVB通过抑制乙烯作用则显著提高外层花瓣的抗脱落能力，外用乙烯释放剂CEPA降低了内、外层花瓣的抗脱落力，揭示花瓣离层结构变化与脱落密切相关。

2.4 花瓣基部乙烯代谢

图4-A所示，‘洛阳红’瓶插期间花瓣基部有明显的乙烯跃变特征。花瓣基部的乙烯释放速率呈现先降低后上升再降低的趋势。CK处理瓶插1 d时降到最低值，4 d时达到乙烯峰值；CEPA明显提高了切花的乙烯峰值，且在瓶插期间一直高于其他处理；AVB降低并推迟了乙烯跃变峰值，乙烯释放速率明显低于CK和 CEPA处理，AVB+CEPA处理的乙烯跃变峰值也显著低于CK。

瓶插前期（0—3 d）花瓣ACC含量变化不明显，之后ACC含量迅速增加。与CK相比，AVB显著降低瓶插中期（4—5 d）时花瓣ACC含量，而CEPA则明显提高了瓶插后期花瓣ACC含量；AVB+CEPA处理仅在瓶插末期（6—7 d）高于CK（图4-B）。花瓣ACS和ACO活性均呈现先升高后降低的趋势，AVB抑制ACS和ACO酶活性，而CEPA促进酶活性，CEPA能部分抵消AVB的效应（图4-C和D）。说明‘洛阳红’花瓣乙烯代谢在调控其衰老过程中有重要的生物学作用。

2.5 花瓣基部生长素代谢

图5-A所示，CK处理花瓣基部IAA含量呈现先迅速上升后缓慢下降的趋势，3 d时达到峰值，而后缓慢下降；AVB在5 d时的花瓣IAA含量达到峰值，末期（6—7 d）显著低于CK，7 d时花瓣萎蔫而没有明显脱落；CEPA末期（5—6 d）花瓣IAA含量显著低于CK；AVB+CEPA 第5天时花瓣IAA含量达到峰值，而后降低接着再升高。说明 AVB能提高瓶插后期花瓣基部IAA含量，而CEPA则降低瓶插后期花瓣基部 IAA含量。瓶插过程中，CK处理的花瓣基部IAAO活性呈现先下降后上升的趋势；AVB降低瓶插末期IAAO活性，CEPA促进瓶插中后期IAAO活性，而AVB+CEPA处理后期IAAO活性一直低于CK（图5-B）。说明‘洛阳红’瓶插中后期，IAA含量和IAAO活性与花瓣衰老脱落存在一定关系。

2.6 水解酶类活性变化

‘洛阳红’花瓣基部的水解酶类活性变化趋势明显（图6）。花瓣PME活性前期上升缓慢，4 d后迅速增加，与CK相比，AVB处理明显降低了PME活性，CEPA显著升高PME活性，CEPA能够抵消AVB的作用。花瓣基部BG和PG活性在瓶插前期变化平缓，瓶插4 d后迅速升高。说明瓶插过程中，花瓣基部的水解酶类活性与花瓣细胞衰老密切相关，其中BG活性升高早于PME和PG。

2.7 花瓣脱落相关基因差异表达

2.7.1 乙烯信号转导基因PsETR1、PsCTR1、PsEIN3、PsERF1的表达 乙烯受体编码基因 PsETR1和PsCTR1表达量呈现先升高后降低趋势（图7-A、B）。CK处理瓶插前期（0.5—3 d）花瓣PsETR1处于较高的表达水平，1—2 d时AVB处理的峰值比CK显著升高了 53.2%和 19.8%，中后期表达量较低；CEPA和AVB+CEPA处理瓶插初期（0.5—1 d）和后期（5—7 d）高于CK。CK处理瓶插3 d时花瓣PsCTR1表达量到达峰值，AVB处理的峰值较CK提前了2 d，CEPA处理较CK有不同程度的降低，AVB+CEPA处理则在前期较低，后期升高，说明PsCTR1的表达受乙烯拮抗剂（AVB）的影响，表达为上调，AVB和 CEPA有拮抗作用。

乙烯转录因子编码基因 PsEIN3在花瓣中的表达量呈现先升高后降低的趋势，瓶插2 d时出现峰值（图7-C）。AVB处理的瓶插初期（0.5—1 d）显著低于CK，后期呈现波动变化；CEPA和AVB+CEPA处理的表达量总体上低于 CK。乙烯响应因子编码基因PsERF1的相对表达量呈现波动式变化趋势（图7-D），AVB处理的瓶插初期表达量增加后迅速下降，4 d时再次达到峰值，CEPA和AVB+CEPA处理初期的表达不明显，1 d后表达量迅速增加。说明外源AVB和CEPA有通过乙烯信号转导系统调控内源乙烯的生理作用。

2.7.2 花瓣生长素合成基因 PsYUCCA10和输出载体蛋白基因 PsPIN1差异表达 花瓣 IAA合成酶基因PsYUCCA10表达量呈现先上升后迅速下降的趋势，第5天出现峰值。AVB处理显著抑制其表达，CEPA处理的表达量在瓶插1 d和4—6 d时显著高于CK。花瓣生长素输出载体蛋白 PsPIN1表达量呈现先上升后下降趋势（图8-B）。AVB处理表达量在瓶插前期（0.5—3 d）显著低于CK，4—6 d时高于CK；CEPA处理瓶插0.5 d时的表达量也显著高于CK，瓶插中期（2—3 d）显著低于CK。结果表明切花瓶插过程中花瓣PsYUCCA10调控着IAA的合成，PsPIN1在生长素运输方面也起到一定的调控作用，外源 AVB抑制花朵开放，CEPA促进花朵开放。

2.7.3 花瓣水解酶基因PsPME1、PsPG1和PsBG1差异表达 由图9可知，瓶插过程中，花瓣PsPME1、PsPG1和PsBG1差异表达，变化模式明显不同。CK处理瓶插早期0.5 d花瓣PsPME1呈现大幅升高后快速下降；AVB下调瓶插前期 PsPME1表达量，上调后期表达量；而CEPA的作用与AVB相反；AVB+CEPA处理的花瓣PsPME1表达量一直处于极低水平。除瓶插后期（5—6 d）外，CK处理瓶插PsPG1表达量呈现先迅速上升后缓慢下降的趋势；AVB下调瓶插前期花瓣PsPG1表达量；CEPA前期（0.5—2 d）显著上调花瓣PsPG1表达量，AVB+CEPA处理的前期（0.5—2 d）上调效应明显。CK瓶插过程中，PsBG1表达量逐渐升高，末期迅速降低；AVB瓶插后期（4—7 d）显著下调 PsBG1表达量。相对于瓶插期间 PsPME1和PsPG1表达量变化，PsBG1在瓶插中后期的持续升高可能与离层细胞解体直接相关。

3 讨论

3.1 乙烯可能通过生长素调控牡丹花瓣脱落过程

植物器官的衰老脱落与乙烯和生长素的激素平衡密切相关，前期有关激素对落花落果的研究主要集中在模式植物拟南芥、番茄。拟南芥乙烯不敏感突变体ETR1-1和EIN2表现出抑制花器官脱落[16]；涉及乙烯信号传导的EIN3-like类基因LeEIL的沉默，延迟了番茄花器官的脱落[42]。外源生长素NAA和生长素运输抑制剂TIBA处理睡莲中间花瓣，白天花朵开启过程中，YUC8、YUC9和YUC10转录水平上调，YUC5在花瓣晚间闭合时表达，表明昼夜花朵开启阶段细胞伸长与闭合阶段细胞收缩的节律运动受到内源生长素代谢的调节[43]。外源ETH能提前AheERF1/2表达高峰出现时间[44]，但在器官脱落过程中乙烯和生长素相互作用的分子机制还有待进一步分析。GAO等[24]检测了ERF在月季花瓣离层中的表达，发现 RhERF1和RhERF4的表达分别受到乙烯和生长素的影响，乙烯与生长素在调控花瓣脱落过程中可能存在拮抗作用。生长素酸生长理论认为，植物细胞伸长生长受到内源生长素的调控[45]。牡丹花的迅速开放是一个花瓣细胞伸长和质量的不可逆生长过程[10]，花瓣的快速伸长生长受到高水平 IAA的调控，而衰老过程伴随着 IAA水平的迅速下降与IAAO活性的上升（图5）。本研究发现 AVB+CEPA预处理能降低花瓣基部的乙烯峰值，但不能推迟乙烯跃变出现时间，两者调节牡丹切花花朵开放与衰老的生理效应存在拮抗作用。表明外源AVB和乙烯能够调节‘洛阳红’切花花瓣内源IAA代谢与转运过程，乙烯调控牡丹切花花瓣落瓣过程可能与内源IAA的作用存在一定的关联性。

3.2 乙烯对离层脱落细胞水解酶类的调控

离层细胞的产生不仅受激素的影响，还受到细胞壁代谢酶类调控。已有研究证实，花朵和果实等植物器官脱落主要受纤维素酶（EG）、PG和PME控制[41]。乙烯不仅加速植物落花落果进程，也能促进离区中诱导合成水解酶类，如纤维素酶和果胶酶[20]。研究表明，乙烯诱导的番茄花柄离区折断强度的下降伴随着细胞壁降解酶活性的升高[46]。齐明芳等[47]认为，β-葡萄糖苷酶属于纤维素酶类，通过糖化作用对花朵离区纤维素进行降解，从而导致花朵凋谢和自动脱落。PG参与多种植物器官的脱落，如大豆花荚[48]和豇豆花荚[49]等。本研究也证实外源乙烯拮抗剂（AVB）显著降低4 d后离层水解酶类活性，下调前期PsPME1和PsPG1表达量，抑制细胞降解；外源CEPA显著提高瓶插4 d后离层水解酶类活性，加速离区细胞壁降解，加快切花的衰老和脱落；AVB+CEPA提高4 d后PG活性，但BG和PME活性与CK相差不大，瓶插中后期AVB与CEPA存在拮抗效应。说明内源乙烯是调节水解酶的重要因素之一。牡丹花瓣离层细胞脱落涉及多重因素，进一步深入其分子生理机制研究能够为切花保鲜技术与长寿命品种培育提供理论支撑。

4 结论

牡丹‘洛阳红’切花瓶插期间存在明显的乙烯跃变，内源IAA含量先上升后下降，提高了乙烯促进衰老的敏感性，切花在瓶插6 d时即出现脱落；乙烯拮抗剂（AVB）推迟乙烯的跃变，并降低乙烯峰值，维持瓶插末期切花IAA含量，提高花瓣抗脱落力，降低离层水解酶类活性和水解酶类基因表达量，有效抑制切花花瓣的脱落；外源乙烯释放剂（CEPA）促进乙烯跃变，提高乙烯释放量，提高瓶插前期花瓣伸长过程中IAA含量，促进花朵开放，显著提高离层水解酶类活性，切花瓶插 5 d时即出现萎蔫脱落；AVB与CEPA存在拮抗效应，能降低乙烯峰值，但不能延迟乙烯跃变。说明内源IAA参与了乙烯调控牡丹‘洛阳红’切花花瓣离层细胞的衰老脱落过程。