刘振志，翟慧媛，袁亮亮，于 雷，卢 宁

1 南京中医药大学附属南京市中西医结合医院 药学部，南京 210014；2 江苏第二师范学院，南京 210013；3 南京市中心医院，南京 210018

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）于1972 年由Glauser 首次报道[1]，又名隐匿性哮喘、过敏性咳嗽。临床主要症状为慢性咳嗽，无明显喘息、气促等症状；但有气道高反应性和气道炎症，与哮喘类似。近年来，CVA 的发病率呈持续上升趋势，严重威胁公众健康，在我国CVA 占儿童慢性咳嗽比例高达41.95%[2]，约30%的患儿最终进展为支气管哮喘。在2002 年的《全球哮喘处理和预防策略》（GINA）上，提出它是支气管哮喘的一种特殊形式，多数学者认为，CVA 的发病机制与支气管哮喘大致相同，主要为慢性非特异性气道炎症和气道重塑[3]。

研究表明，基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）可降解肺组织细胞外基质和基底膜，且能调节蛋白酶和细胞因子的活性，在支气管哮喘气道重塑的病理过程中发挥着重要作用。基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）是MMP-9 的生理性抑制剂，其反应性的升高可导致胶原沉积，进一步引起气道重塑[3]。本研究通过检测大鼠肺组织MMP-9 和TIMP-1 mRNA 表达，进而探究钩薄过敏颗粒对咳嗽变异性哮喘大鼠气道重塑的影响，更深入的阐述该品治疗咳嗽变异性哮喘可能的作用机制。

1 材 料

1.1 药品和试剂

钩薄过敏颗粒由钩藤、薄荷、桔梗、鱼腥草、炙甘草、黄芪等配方颗粒组成（批号19041291，颗粒剂均采自江阴天江药业有限公司），生理盐水配制成1.342、2.863 g·mL-1的混悬液备用；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制药有限公司，5 mg/片，批号180687），生理盐水配制成0.05 mg·mL-1的溶液备用。

卵蛋白（OVA）、氢氧化铝（中国阿拉丁公司）；TIMP-1 抗体、MMP-9 抗体（Proteintech 公司）；βactin（Abcam 公司）；TRIzol（1596-026）（Invitrogen 公司）；SYBR Green PCR 试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（均为Thermo 公司）；水为重蒸水。

1.2 实验仪器

Multiskan MK3 酶标仪（Thermo 公司）；Realtime 检测仪（Bio-Rad 公司）；DYY-6C 型电泳仪（北京六一仪器厂）；420AI 超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；Sartorius B71250 电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；凝胶成像分析系统（Bio-Rad 公司）。

1.3 实验动物

SPF 级健康SD 大鼠，雄性，30 只，6 周龄，体重180～240 g（上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供），生产许可证号为SCXK（沪）2018-0006，实验动物使用许可证号为SYXK（苏）2017-0015。

1.4 引物

RT-PCR 引物由上海生工生物技术有限公司合成。TIMP-1 扩增片段大小为482bp，上游引物：5’-TGCAACTCGGACCTGGTTAT-3’，下游引物：5’-GGTTCTGGGACTTGTGGACA-3’；TIMP-1 扩增片段大小为496bp，上游引物：5’-TGCGCTGGGCTTAGATCATT-3’；下游引物：5’-TGCAGTGGGACACATAGTGG-3’；β-actin 扩增片段大小为287bp，上游引物：5’-ATCGTAAAGACC TCTATGC-3’；下游引物：5’-AACGCAGCTCA GTAACAGTC-3’。

2 方 法

2.1 动物模型建立、分组及给药

将30 只雄性SD 大鼠按照体重随机等分为5组，分别为：正常组、模型组、地塞米松（0.5 mg·kg-1）组、钩薄过敏颗粒低、高剂量组（13.42、28.63 g·kg-1），每组6 只。除正常组外，其他组均按照以下方法造模：新配制的10%OVA 和Al（OH）3混合液1 mL 皮下注射致敏。注射方法为：每只大鼠取两后足跖、腹股沟部、腰部、背部和颈部共10 点，每点皮下注射0.05 mL，同时腹腔注射0.5 mL，共计1 mL；1 周后重复1 次加强致敏。造模第15 天起，隔日上午雾化吸入：将大鼠置于密闭的有机玻璃罩中，用超声雾化仪在400 mmHg 恒压下喷入1% OVA 溶液20 min，激发哮喘。以大鼠腹肌明显收缩为阳性，直到出现呼吸加深、加快、口鼻分泌物增多、剧烈呛咳等呼吸道痉挛症状，提示造模成功。

空白组以生理盐水替代OVA。各组于第15 天开始给药，连续13 天，通过灌胃给药（1 mL/100 g）。正常组和模型组给予同体积重蒸水。

2.2 动物处置及标本制备

大鼠于第28 天末次给药后，禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）进行麻醉，处死动物。留取肺组织：打开胸腔，结扎左侧肺门，切取大鼠左肺上叶组织，置于冻存管内，随后迅速移入-80 ℃液氮中冻存，以进行RT-PCR 检测mRNA 表达；切取左肺下叶组织放入冻存管，随后迅速置于液氮中保存，以进行Western-blot 检测相关蛋白表达。

2.3 实时定量PCR 检测肺组织中TIMP-1 mRNA、MMP-9 mRNA 水平

①用TRIzol 法提取组织总RNA：称取50～100 mg 组织，置于研钵中，加入少许液氮迅速研磨，研磨至粉末状；转移至无酶的1.5 mL 离心管中，加入1 mL TRIzol 剧烈振荡，室温裂解10 min；12 000 r·min-1离心5 min，弃沉淀，上清液加入总体积1/5 氯仿，涡旋振荡15 s，室温静置10 min，12 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液于新的无酶1.5 mL 离心管中；加入等体积异丙醇，上下颠倒8～10 次，静置10 min，12 000 r·min-1离心10 min，弃上清液；每管加入1 mL 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水配制的75%乙醇，温和振荡悬浮沉淀，7500 r·min-1离心10 min，弃上清液，晾至半透明；加入50～100 μL DEPC 水溶解沉淀，待充分溶解后以荧光分光光度计检测RNA 浓度。②RNA 逆转录为cDNA：在200 μL离心管中分别加入dNTP Mixture（各10 mmol·L-1），Oligodt 引物（2.5 μmol·L-1），总RNA（1 μg），RNAse Free ddH2O 补至总体积20 μL。在PCR 仪上进行逆转录反应，37 ℃15 min（反转录反应），85 ℃5 s（反转录酶的失活反应）。③SYBRGreen 法进行实时荧光定量PCR：按照下述比例在冰上配制SYBRGreen（5X）10 μL，引物F（10 μmol·L-1）1 μL，引物R（10 μmol·L-1）1μL，上述cDNA 1μL，dd H2O 补至总体积20μL，上机进行实时荧光定量PCR 反应。扩增条件为：95℃3min 预变性后，95℃15s 变性，60℃60s 退火、72℃60 s 延伸，共循环40 次。④数据计算：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，用2-ΔCt表示某样本某基因表达水平，2-ΔΔCT计算基因表达的相对比值。

2.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）检测CVA 大鼠肺组织中TIMP-1、MMP-9 蛋白的表达

①样品准备：称取50～100 mg 大鼠肺组织，少许液氮迅速研磨至粉末状；转移至1.5 mL EP 管中，加入600 μL 含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，40 V 冰上超声30s，冰上裂解20min，4℃下12000r·min-1离心20 min，小心吸取上清液；Bradford 法测定蛋白浓度，酶标仪上检测蛋白浓度；加入5×SDS，95 ℃金属浴10 min 变性蛋白，1×SDS 调至相同蛋白浓度备用。②Western blot：SDS-PAGE 胶配制，分离胶浓度10%；每孔上样量20 μg，体积15～20 μL，80 V 电泳至浓缩胶结束，样品进入分离胶时间约30 min，分离胶120 V，60～90 min；将样品从SDS-PAGE 胶转移至PVDF 膜上，冰上100 V，60 min；配制5%脱脂奶粉放入转膜后的PVDF 膜，室温下于脱色摇床上60 min；一抗孵育：加入一抗4 ℃过夜；1×TBST，脱色摇床上10 min/次，重复3 次；二抗孵育：加入二抗室温孵育60 min；洗膜：1×TBST，脱色摇床上10 min/次，重复3 次；显色：配制化学发光显色液，A∶B=1∶1，置于自动电泳凝胶成像分析仪曝光，Image J 软件灰度扫描分析。

2.5 统计学处理

采用SPSS17.0 统计学软件处理。各组实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肺组织TIMP-1、MMP-9mRNA 表达的比较

与正常组相比，模型组大鼠肺组织中MMP-9和TIMP-1 的mRNA 水平明显升高（P＜0.01），与模型组相比，钩薄过敏颗粒高剂量组MMP-9 和TIMP-1 的mRNA 水平显著降低（P＜0.01），说明钩薄过敏颗粒能够抑制OVA 模型组肺组织MMP-9和TIMP-1 的表达。见表1。

表1 钩薄过敏颗粒对TIMP-1 和MMP-9mRNA 表达水平的影响（±s，n=6）

表1 钩薄过敏颗粒对TIMP-1 和MMP-9mRNA 表达水平的影响（±s，n=6）

3.2 各组大鼠肺组织TIMP-1、MMP-9 蛋白表达的比较

Western-blot 法检测各组大鼠肺组织中TIMP-1 和MMP-9 蛋白表达水平，显影结果见图1。

图1 各组肺组织TIMP-1、MMP-9 蛋白表达结果

用Image J 软件对图片进行灰度扫描，记录蛋白表达水平（以测定蛋白/β-actin 灰度值计），并进行组间比较，结果见表2。

表2 钩薄过敏颗粒对TIMP-1 和MMP-9 蛋白表达水平的影响（±s，n=6）

表2 钩薄过敏颗粒对TIMP-1 和MMP-9 蛋白表达水平的影响（±s，n=6）

与正常组相比，模型组大鼠肺组织中TIMP-1和MMP-9 表达明显增多（P＜0.01），而与模型组相比，钩薄过敏颗粒低剂量组TIMP-1 蛋白表达无差异（P＞0.05），MMP-9 蛋白表达明显减少（P＜0.01），地塞米松组和钩薄过敏颗粒高剂量组TIMP-1 和MMP-9 表达降低（P＜0.01），有统计学显著意义，说明钩薄过敏颗粒能够抑制CVA 大鼠肺组织中TIMP-1 和MMP-9 蛋白的表达。

4 讨论

课题组前期研究已证实，钩薄过敏颗粒治疗CVA 临床疗效确切，并观察到该品可以减少动物模型肺组织的炎性浸润以及通过调控炎症因子水平而减轻气道炎症[4，5]。钩薄过敏颗粒以钩薄过敏煎汤（以下简称“过敏煎”）（五味子、乌梅、银柴胡、防风）为基础，具体有钩藤、薄荷、银柴胡、防风、黄芪、桔梗、鱼腥草、虎杖、生甘草、紫菀、乌梅、马鞭草、款冬花等13 味中药组成，钩藤、薄荷为常用对药，钩藤息风、解痉，薄荷解郁利咽，两者配合可清热解痉、利咽止咳；银柴胡、黄芪、防风、乌梅、甘草在临床中有较强的抗变态反应作用，具有祛风止痒、解痉止咳之功，其中用黄芪代替过敏煎中五味子，取其补益肺气、增强机体免疫力；鱼腥草、虎杖、马鞭草是临床常用止咳对药，有清热、利咽、止咳、活血之功；桔梗、紫苑止咳化痰。全方“祛风论治”，疏肝泄热、熄风止痉[6]。

现代医学发现，在CVA 的发病过程中，慢性的气道炎症会引起气道壁局部组织的损伤，而气道重塑的最初原因是机体因为气道炎症所产生的反应性修复，修复与损失的失调最终会起到重塑的发生。细胞外基质（ECM）在气道壁的过多沉积是引起重塑的主要原因之一，也是CVA 的重要病理机制之一。基质金属蛋白酶-9 是调节ECM 代谢的主要限速酶。在CVA 发作期，MMP-9 升高，基底膜的完整性遭到破坏，大量炎性细胞浸润气道壁，导致气道炎症反应及气道高反应性。MMP-9 还可黏附IL-8，并加强IL-8 作为中性粒细胞趋化因子的活性，活性加强后IL-8 的趋化作用至少高于正常的10 倍，因此肺组织中的MMP-9 水平与其炎症反应的严重程度及ECM 沉积的严重程度密切相关。此外，MMP-9 的持续性升高促进其抑制因子基质金属蛋白酶抑制剂-1 反应性升高，抑制胶原分解，导致胶原沉积。细胞外基质成分在气道壁的过多沉积可引起气道壁的纤维化和气流受阻，导致气道重塑的发生[6，7]。

本研究显示，CVA 大鼠模型组肺组织的TIMP-1、MMP-9 mRNA 和蛋白的表达显著增加，提示TIMP-1、MMP-9 参与了CVA 的发生发展过程。钩薄过敏颗粒低、高剂量组大鼠肺组织中TIMP-1、MMP-9 mRNA 和蛋白表达水平较模型组降低，其中对MMP-9 mRNA 和蛋白的抑制作用更为明显。提示钩薄过敏颗粒可有效改善CVA 大鼠咳喘症状、减轻气道炎症，其机制可能与下调TIMP-1、MMP-9 表达、抑制气道重塑有关。