温 娜， 张国梅*， 李德芳， 吴钰周， 双少敏*

(1.山西大学化学化工学院，山西太原 030006;2.华中科技大学化学化工学院，湖北武汉 430074)

维生素B12(VB12)又叫钴胺素，它是一种水溶性维生素。自然界中的VB12都是微生物合成的。动物源性食物中基本上没有维生素B12，而动物内脏、肉类、蛋类是VB12的主要来源。VB12可以有效地预防恶性贫血、老年痴呆、抑郁症等[1]疾病。VB12缺乏会导致贫血、心血管疾病和神经损伤，但过量的VB12也会产生副作用，例如引起肝病和肾衰竭。因此，建立一种检测VB12的方法非常重要。目前检测VB12的方法有高效液相色谱、质谱、毛细管电泳[2 - 5]等方法。但是这些方法需要昂贵的设备，较长的反应时间和复杂的样品预处理。因此寻求一种简便快速检测VB12的方法是必要的。近年来，随着纳米材料的发展，一些纳米材料已被广泛应用于检测VB12，例如有机染料[6]、碳点(CDs)[7,8]。Yu等[9]以氨基丙基三氧硅烷作为碳源，柠檬酸钠作为还原剂合成的硅量子点((SiQDs)检测VB12，方法的线性范围为0.5～16.0 μmol·L-1，检出限为158 nmol·L-1。Dong等[10]以蔗糖、H3PO4和1,2-乙二胺(EDA)为碳源，制备磷氮双掺杂碳点(PN-CDs)来检测VB12。

金属纳米簇由于具有水溶性好、毒性小和生物相容性好等优点被用作新型的荧光纳米材料[11]。这些优越的特性表明了纳米簇在化学传感、生物传感和催化剂等方面的突出优势。但到目前为止，没有以乙醇作为溶剂合成纳米簇用于VB12检测的报道。在本工作中，以多巴胺(DA)作为保护剂,NaBH4作为还原剂，乙醇作为溶剂，采用一锅法合成了多巴胺保护的银纳米簇(DA@Ag NCs)，而VB12可以有效地猝灭DA@Ag NCs的荧光，因此DA@Ag NCs可以作为荧光探针检测VB12。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

JEM-2100F场发射透射电子显微镜(日本，电子株式会社)；X射线光电子能谱仪(英国，Kratos公司)；F-4500荧光分光光度计(日本，日立公司)；UV-2910紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；BS124S电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

盐酸多巴胺、AgNO3、NaBH4购买于上海麦克林生化科技有限公司；NaOH购买于天津市风船化学试剂科技有限公司。实验用水为Milli-Q超纯水(>18.2 MΩ·cm)。

1.2 DA@Ag NCs的合成

DA@Ag NCs的合成路线如图1所示。

图1 DA@Ag NCs的合成示意图

将4 mL 10 mmol/L的DA在搅拌中加入到1 mL 10 mmol/L的AgNO3溶液中。室温下继续搅拌10 min,然后加入150 μL 1 mol/L的NaOH溶液，溶液由无色变为深棕色溶液，继续搅拌5 min后，加入100 μL 1 mol/L的NaBH4溶液，在55 ℃水浴中反应10 h,得到了黄色的DA@Ag NCs溶液。将该溶液静置一段时间，离心5 min后移出溶液，将DA@Ag NCs溶液放在冰箱中冷藏保存，备用。

1.3 pH值的优化

将100 μL DA@Ag NCs溶液，10 μL VB12溶液和890 μL不同pH值的磷酸盐缓冲溶液(PBS)混合于比色皿中，2 min后，在激发波长468 nm处测量荧光强度(激发和发射狭缝宽度均为10 nm)。

1.4 VB12的检测

将100 μL DA@Ag NCs溶液，300 μL超纯水和600 μL PBS混合于比色皿中，然后加入不同浓度的VB12溶液,反应2 min后，在激发波长468 nm处测量荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 DA@Ag NCs的表征

图2(A)为DA@Ag NCs的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱图，其荧光最大激发和发射波长分别为458 nm和536 nm。插图中DA@Ag NCs在日光下呈黄色，在365 nm的紫外波长线灯下呈绿色。图2(B)为纯DA与DA@Ag NCs的紫外-可见吸收光谱，与DA相比，DA@Ag NCs在约280 nm波长处出现明显的吸收峰，可以进一步说明合成了DA@Ag NCs。

X射线光电子能谱(XPS)全谱图提供了合成的Ag NCs的组成，如图2(C)所示，表明DA@Ag NCs中含有C、O、N、Ag等元素。图2(D)为Ag 3d的XPS谱图，Ag 3d5/2的结合能为368 eV,为Ag(0)的特征吸收峰，表明Ag NCs中存在Ag(0)[12]。

图2(E)为Ag NCs的透射电镜(TEM)图，从图中可以看出Ag NCs外观类似球形，分散性较好，粒径分布均匀，粒径大约在2.61 nm。图2(F)为DA和DA@Ag NCs的红外(IR)光谱图，由图中可知3 500～3 200 cm-1为羟基/氨基的伸缩振动，3 072 cm-1为苯环上C-H键的伸缩振动，879 cm-1、817 cm-1为苯环取代基的特征吸收峰，1 619 cm-1和1 503 cm-1分别为N-H的弯曲振动和苯环上C=C振动。而在DA@Ag NCs中这两个特征峰则出现在1 602 cm-1、1 494 cm-1，并且苯环取代基的特征吸收峰消失，这可能是因为DA与AgNO3之间发生了反应。

图2 (A)DA@Ag NCs的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱图(插图为DA@Ag NCs在日光下的照片(左)和365 nm紫外灯下的照片(右));(B)DA与DA@Ag NCs的紫外-可见吸收光谱；(C)Ag NCs的X射线光电子能谱(XPS)全谱图;(D)Ag NCs中Ag 3d的XPS谱图；(E)DA@Ag NCs的透射电镜(TEM)图和粒径分布图；(F)DA@Ag NCs和DA的红外(IR)光谱图

2.2 DA@Ag NCs在不同溶剂中的荧光性能分析

对合成的DA@Ag NCs在不同溶剂，如甲醇、乙醇、DMF等中的荧光性能进行研究。结果表明：随着有机溶剂体积分数的增加，DA@Ag NCs的荧光强度逐渐增强。如图3(A)所示，随着乙醇体积分数增加，DA@Ag NCs荧光光谱峰形没有发生变化，但荧光强度不断增加。基于此，用乙醇为溶剂合成Ag NCs的荧光效率大大增强。图3(B)为乙醇为溶剂合成的Ag NCs，及以水为溶剂合成的Ag NCs荧光光谱图。与水相比，以乙醇为溶剂时其荧光强度约增大10倍。以香豆素307(量子产率为0.56)为参比，DA@Ag NCs的量子产率为6.8%。

图3 (A)DA@Ag NCs在不同含量的乙醇溶液中的荧光光谱图；(B)以水为溶剂合成的DA@Ag NCs和以乙醇为溶剂合成的DA@Ag NCs的荧光光谱图

2.3 DA@Ag NCs荧光猝灭和选择性实验

优化实验条件，探索VB12诱导DA@Ag NCs荧光猝灭的实验，如图4(A)所示，随着VB12的浓度从0 μmol/L增加到80 μmol，DA@Ag NCs荧光强度逐渐减弱。在458 nm处F/F0值(F0和F分别代表不存在和存在VB12时Ag NCs的荧光强度)逐渐降低，并在5～80 μmol/L浓度范围内均呈现良好的线性关系，线性方程为：F/F0=0.9530+0.0089c(R2=0.9910)，检出限(S/N=3)为588 nmol/L。线性关系如图4(B)所示。

在相同的实验条件下，考察DA@Ag NCs对VB12的选择性。实验考察了VB1、VB3、VB6、VB7、VB9、VC、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸、谷氨基酸、天冬酰胺、缬氨酸、苯丙氨酸、Al3+、Hg2+、Cr3+、Ag+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ba2+、Pb2+、Co2+和Fe2+对DA@Ag NCs的响应。如图4(C)和4(D)所示：加入VB12后的DA@Ag NCs荧光发生明显的猝灭，而所考察的维生素和氨基酸，以及金属阳离子对DA@Ag NCs的荧光强度几乎没影响，可见DA@Ag NCs对VB12有较高的选择性。

图4 (A)不同浓度VB12(0～80 μmol/L)对DA@Ag NCs荧光光谱的影响；(B)DA@Ag NCs荧光强度比值(F/F0)与VB12浓度的线性曲线图；(C)DA@Ag NCs对不同小分子的响应；(D)DA@Ag NCs对不同金属离子的响应

如表1所示，通过与其他检测VB12的方法相比，该方法检测VB12具有较宽的线性范围。

表1 DA@Ag NCs与不同荧光纳米材料的检测VB12方法的比较

2.4 VB12对DA@Ag NCs猝灭机理

图5(A)所示为VB12的紫外-可见吸收光谱和DA@Ag NCs的荧光发射光谱，从图中可以看出VB12的吸收光谱与DA@Ag NCs的荧光发射光谱有很大程度的重叠，说明荧光强度下降可能是由内滤效应引起的。为了进一步探究猝灭机理，测量了VB12浓度对纳米簇寿命的影响。如图5(B)所示，发现加入VB12后DA@Ag NCs的荧光寿命几乎没有变化，进一步说明DA@Ag NCs的荧光猝灭是由内滤效应引起。

图5 (A)VB12的紫外-可见光谱图和Ag NCs的发射光谱图；(B)DA@Ag NCs和DA@Ag NCs-VB12的荧光寿命

2.5 实际样品中VB12的检测

为了评估DA@Ag NCs在实际样品中对VB12检测的可行性，测定了药片、滴眼液中VB12的含量。采用加标回收法，结果如表2所示，测定的回收率在98.17%～100.93%范围，相对标准偏差(RSD)小于3.0%，说明DA@Ag NCs可用于实际样品的测定。

表2 实际样品中VB12的测定结果

3 结论

在本研究中，以一种简单易得的方法合成了Ag NCs。此外，由于乙醇特殊的溶剂效应使Ag NCs的荧光强度极大增强，因此选用乙醇作为溶剂合成发光效率高的Ag NCs。由于VB12能有效猝灭Ag NCs的荧光，且在5～80 μmol/L呈良好的线性关系，成功建立了基于Ag NCs的荧光猝灭法测定VB12，并用于实际样品的检测，结果较好。