戴意强，吴 寒，单成俊，刘小莉，王 英，程先玲，周剑忠，夏秀东

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏南京210014；2.江苏惠田农业科技开发有限公司，江苏扬州211400)

黑莓属于多年生木本植物，黑莓果成熟时为紫黑色，柔软多汁，味道酸中带甜[1]。黑莓含有丰富的营养物质，如维生素E和维生素K[2]，多种矿物质元素[3]，大量具有高生物活性的酚类化合物(包括花色苷、黄酮醇、鞣花酸、绿原酸、没食子酸、单宁和槲皮素等)。这些物质使得黑莓具有多种生物活性功能，如抗氧化、调节代谢、提高免疫、消除疲劳和延缓衰老等，特别是在防治心脏疾病、降低胆固醇含量和抗癌等方面具有独特的功效[4]。黑莓的采收季节(夏季)温度高，且黑莓果实水分含量高、质地较软，使得黑莓的储藏和运输非常困难，因此，除极少部分鲜食外，大部分黑莓都用于深加工。目前市场上主要的黑莓产品为黑莓果汁、黑莓酒和黑莓果干等，但是与其相关的发酵饮料较少。

红茶菌也被称为海宝或胃宝，以糖茶水为原料，经一种或多种酵母菌和醋酸菌、少部分含有乳酸菌混合发酵而成[5]。红茶菌发酵受共生微生物驱动，在发酵过程中会发生许多生物化学反应，主要包括醇、醛的形成，以及醇、醛向酸、酯的转化[6]，其主要代谢产物包括醋酸、乳酸、乙醇、葡萄糖醛酸、游离氨基酸和维生素等[7]。因此，红茶菌产生的次级代谢产物及底物构成了发酵产品中主要的风味物质[8]。此外，红茶菌对人体健康有许多有益的作用，如抗氧化、降血脂、抗高血糖、抗菌、降糖和抗癌等[9]。

为解决黑莓难以储藏的问题，丰富黑莓产品种类，本研究以黑莓汁为原料，通过红茶菌发酵以改善黑莓汁风味和口感，提高黑莓汁功能特性。本文研究在不同发酵温度和发酵时间下，红茶菌发酵黑莓汁中微生物数量、pH、色差以及多糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、有机酸和花色苷含量的影响，以期开发一种全新的红茶菌发酵黑莓汁饮料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红茶菌来自于江苏省农业科学院农产品加工研究所实验室，保藏于红茶水中，主要的微生物菌系为醋酸菌、酵母菌和乳酸菌；黑莓来源于南京市溧水区白马种植基地。

蔗糖、葡萄糖、果糖、草酸、L-苹果酸、乙酸和乳酸标准品，上海源叶生物科技有限公司；苯酚、浓H2SO4、KH2PO4、无水乙醇、KCl和NaAc，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FiveEasy Plus pH计，梅特勒-托利多有限公司；3nH台式色差仪，深圳市三恩时科技有限公司；Agilent 1290型高效液相色谱，安捷伦科技有限公司；3K15型离心机，美国Sigma公司。

1.3 红茶菌发酵黑莓汁工艺

参照文献[10]的方法，红茶菌种子液是由红茶菌在含糖红茶水中培养得到。将红茶菌种子液3 000 r/min离心5 min，去上清液后，用无菌水清洗沉淀后再次离心，重复3次，得到红茶菌接种液(微生物数量为107～108CFU/mL)。将黑莓清洗、沥干后破碎打浆，离心后得到黑莓汁。将1 L黑莓汁放入2 L的圆柱形发酵罐中(直径为12 cm，高为19.5 cm)，并于85 ℃下杀菌20 min。待冷却后，接入体积分数5%的红茶菌接种液，并分别在28和37 ℃下静置发酵20 d。

1.4 发酵黑莓汁中微生物数量的测定

将红茶菌接入黑莓汁中后，每隔2 d取一次样，并通过文献[11]的方法测定发酵过程中醋酸菌、酵母菌和乳酸菌数量的变化。微生物荧光定量PCR反应中引物及序列如表1所示。

表1 醋酸菌、酵母菌和乳酸菌特异性引物的名称及序列

1.5 pH和色差的测定

将发酵黑莓汁混匀后，用pH计直接测定发酵黑莓汁pH。发酵黑莓汁的L*、a*和b*值用台式色差仪直接测定：L*为亮度，正值时表示色泽明亮，负值时表示色泽较暗；a*为红绿色，正值时表示红度，负值时表示绿度；b*为黄蓝度，正值时表示黄度，负值时表示蓝度。

1.6 发酵黑莓汁中多糖含量的测定

吸取1 mL发酵黑莓汁，置于50 mL具塞离心管中，加入20 mL无水乙醇，涡旋振荡，于4 ℃提取1 h后，4 000 r/min离心10 min，弃上清液；不溶物用80%乙醇溶液洗涤后再次离心，将沉淀用去离子水溶解后离心，取上清液，残渣洗涤2次；将所有上清液转入50 mL容量瓶中并加水定容。1 mL试样中加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL浓H2SO4，混匀后30 ℃水浴20 min，490 nm处测定吸光值，根据葡萄糖溶液标准曲线计算出多糖含量。

1.7 发酵黑莓汁中蔗糖、葡萄糖和果糖含量的测定

发酵黑莓汁经11 000 r/min离心后过0.45 μm滤膜，样品稀释10倍后测定。将标准品蔗糖、葡萄糖和果糖用超纯水制备成10 mg/mL的母液待用。流动相为水，流速为0.5 mL/min，色谱柱为Agilen Hi-Plex Ca糖分析柱(7.7 mm×300 mm，8 μm)，检测器为示差折光检测器，柱温为80 ℃，进样量为25 μL。以质量浓度(1.0、0.8、0.4、0.2和0.1 mg/mL)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，由标准曲线得到发酵黑莓汁中蔗糖、葡萄糖和果糖含量。

1.8 发酵黑莓汁中有机酸的测定

根据参照文献[10]的方法测定发酵黑莓汁中有机酸含量。发酵黑莓汁经11 000 r/min离心，上清液用0.45 μm滤膜过滤。HPLC条件：色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为20 mmol/L KH2PO4(pH 2.4)，含体积分数3%甲醇；流速0.6 mL/min；柱温28 ℃；检测波长220 nm。

1.9 发酵黑莓汁中花色苷含量的测定

参照文献[14]的测定方法。取2份0.1 mL的发酵黑莓汁，分别加入0.2 mol/L的KCl(pH 1.0)和0.2 mol/L的醋酸钠(pH 4.5)0.9 mL，反应1 h后，分别测定样品在510和700 nm处的吸光值。利用下式计算花色苷含量。

花色苷含量=ΔAWmD×1 000/ε

(1)

式中：ΔA为[(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5]，mg/L；Wm为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子质量449.2；D为稀释倍数；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数(26 900)。

1.10 数据统计与分析

所有数据均来自3个重复的试验，结果以“平均值±标准差”表示。采用SPSS 16.0软件进行数据统计分析，采用Duncan’s法进行多重比较。

2 结果与讨论

2.1 黑莓汁发酵过程中微生物数量的变化

红茶菌发酵黑莓汁过程中主要的微生物为醋酸菌、酵母菌和乳酸菌。黑莓汁中醋酸菌、酵母菌和乳酸菌的初始数量分别为3.12，2.78和2.39(以lg(CFU/mL)计)。加入红茶菌后，黑莓汁发酵过程中微生物数量的变化如图1所示。由图1可知：当发酵温度为28 ℃时，醋酸菌和乳酸菌数量在发酵前6天呈上升趋势，此后趋于稳定，酵母菌数量在前4天呈上升趋势；当发酵温度为37 ℃时，醋酸菌和酵母菌数量在前2天呈上升趋势，此后趋于稳定，乳酸菌数量在发酵前6天呈上升趋势。醋酸菌、酵母菌和乳酸菌能在黑莓汁中大量生长，但其在28和37 ℃时的数量不同，这可能是因为温度对微生物的生长和发酵过程具有重要的影响[15]。此外，在接种相同含量的红茶菌后，在28 ℃时发酵黑莓汁中醋酸菌的数量高于37 ℃时的数量。这可能是因为醋酸菌最适生长温度为28～30 ℃，当条件温度高于30 ℃时，醋酸菌的生长受到抑制[16]；而37 ℃时发酵黑莓汁中乳酸菌的数量高于28 ℃时的数量，这表明37 ℃更有利于红茶菌中乳酸菌在黑莓汁中的生长。

图1 红茶菌发酵黑莓汁过程中微生物数量的变化Fig.1 Changes of microbial amount in Kombucha-fermented blackberry juice

2.2 黑莓汁发酵过程中pH的变化

未发酵的黑莓汁pH为3.22，红茶菌在28和37 ℃时发酵黑莓汁的pH变化如图2所示。由图2可知：当发酵至第12天时，发酵黑莓汁在28和37 ℃时的pH分别下降至2.67和3.05，此后红茶菌发酵黑莓汁的pH趋于稳定。

2.3 黑莓汁发酵过程中色差的变化

颜色是评价果汁质量的重要指标。本文中，笔者研究了不同发酵天数和发酵温度下红茶菌发酵黑莓汁色差的变化，结果如表2所示。由表2可知：未发酵黑莓汁的L*、a*和b*值分别为15.56、43.38和24.01；随着发酵天数的增加，28和37 ℃时发酵黑莓汁的L*、a*和b*值增大；当发酵天数为20 d时，在28和37 ℃时发酵黑莓汁的L*、a*和b*值分别为18.90、46.32、27.77和17.92、44.44、27.63。这表明红茶菌发酵会使黑莓汁颜色变得明亮，红色和黄色增加。在28 ℃时黑莓汁的L*、a*和b*值均高于37 ℃时发酵黑莓汁的数值，这可能是因为受微生物菌系及其代谢产物影响，此外，温度的升高也会导致L*、a*和b*值的降低[17]。

表2 红茶菌发酵黑莓汁过程中色差的变化

28 ℃下发酵黑莓汁的pH始终低于37 ℃时发酵黑莓汁的pH，这主要与不同温度下黑莓汁发酵过程中醋酸菌和乳酸菌的数量有关。在红茶菌发酵黑莓汁过程中，由于温度的不同，导致微生物在数量及产酸能力上出现差异，进而造成发酵黑莓汁pH的不同。

图2 红茶菌发酵黑莓汁过程中pH的变化Fig.2 Changes of pH in Kombucha-fermented blackberry juice

2.4 红茶菌发酵黑莓汁过程中多糖含量的变化

在28和37 ℃时红茶菌发酵黑莓汁中多糖含量变化如图3所示。由图3可知：发酵黑莓汁中的多糖含量随时间延长呈现先增加后平稳的趋势，这表明黑莓汁中的营养物质能够满足红茶菌合成多糖的需求；此外，红茶菌在28 ℃时所产多糖含量显著高于在37 ℃时所产多糖含量，说明发酵温度为28 ℃更有利于红茶菌在黑莓汁中产多糖。柯乐芹等[18]研究不同培养温度对红茶菌产胞外多糖的影响时发现，红茶菌发酵液中胞外多糖含量随着温度上升呈现先增加后降低的趋势，且28 ℃时红茶菌发酵液中胞外多糖含量高于37 ℃时红茶菌发酵液的胞外多糖含量。

图3 红茶菌发酵黑莓汁过程中多糖含量的变化Fig.3 Changes of polysaccharide content in Kombucha-fermented blackberry juice

表3 红茶菌发酵黑莓汁过程中糖分的变化

2.5 红茶菌发酵黑莓汁过程中蔗糖、葡萄糖和果糖的变化

在红茶菌发酵红茶水过程中，蔗糖是唯一的碳源和能源，发酵过程可以使得蔗糖酶解成葡萄糖和果糖[19]。表3为红茶菌发酵黑莓汁过程中糖分的变化。由表3可知：蔗糖、葡萄糖和果糖可以作为碳源和能源来维持红茶菌的生长。未发酵的黑莓汁中，蔗糖、葡萄糖和果糖的质量浓度分别0.21、23.90和32.30 mg/mL；当发酵温度为37 ℃时，发酵黑莓汁中的葡萄糖含量随发酵时间的延长逐渐降低，而蔗糖和果糖含量无显著性差异(p>0.05)，这与Xia等[11]研究结果一致：红茶菌在37 ℃时发酵豆乳过程中首先利用半乳糖和葡萄糖，其次利用蔗糖和果糖。

当发酵温度为28 ℃时，发酵黑莓汁中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量逐渐降低，其中蔗糖和果糖分别在发酵的第8天和第12天耗尽。红茶菌中的酵母菌和醋酸菌处于共生状态，醋酸菌由于缺乏相关的蔗糖水解酶和激酶无法利用蔗糖[19]，而酵母菌由于含有蔗糖水解相关的酶，可以将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，因此醋酸菌可以利用这些糖维持生长[20]。在红茶菌发酵黑莓汁过程中，蔗糖主要被酵母菌分解成葡萄糖和果糖，后者可以作为碳源和能源维持细菌生长所需。

2.6 黑莓汁发酵过程中有机酸的变化

红茶菌在发酵过程中可将碳水化合物转化为有机酸，如乙酸、乳酸、葡萄糖酸和葡萄糖醛酸等[11]。在发酵初期，红茶菌中的酵母可以将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并产生有机酸、乙醇和CO2[21]。醋酸菌则可以将乙醇转化成乙酸，此外还可以将单糖转化为葡萄糖酸、乙酸和乳酸等有机酸[22]。

红茶菌发酵黑莓汁过程中有机酸含量的变化如表4所示。由表4可知：当发酵温度为28 ℃时，乙酸是发酵黑莓汁中主要的有机酸，是导致pH降低的主要物质，且发酵黑莓汁中乙酸和乳酸含量随发酵时间的延长而增加，分别在发酵的第12天和第20天，其质量浓度达到最大值，分别为19 660.55和533.44 mg/L；草酸随发酵时间的延长呈现先减少后增加的趋势，并在第16天，其质量浓度达到最小值，为4.86 mg/L。当发酵温度为37 ℃时，发酵黑莓汁中的L-苹果酸含量随发酵时间的延长呈现先减少后增加的趋势，而乳酸和乙酸含量则呈现先增加后减少的趋势，其中乳酸和乙酸质量浓度分别在第12天和第4天达到最大，分别为807.09和27.50 mg/L。因此，28和37 ℃分别是红茶菌在黑莓汁中产乙酸和乳酸的最佳温度，这与醋酸菌和乳酸菌的最适生长温度一致(图1)。此外，37 ℃时发酵黑莓汁中的乳酸含量显著高于28 ℃发酵黑莓汁中的乳酸含量，但其乙酸含量显著低于发酵温度为28 ℃的黑莓汁中的乙酸含量，这是因为醋酸菌的最适生长温度一般为30 ℃，当温度上升至37 ℃时，醋酸菌产酸能力受到抑制，但是该条件下却有利于乳酸菌生长[16]。

表4 红茶菌发酵黑莓汁过程中有机酸含量的变化

2.7 黑莓汁发酵过程中花色苷的变化

花色苷是由花色苷元和糖分子通过糖苷键相连构成的，是一类颜色独特的酚类物质，含有该物质的食品在加工中具有强烈色彩(主要是对红色、蓝色和紫色有贡献)[23]。花色苷易受温度、pH和有机酸等因素的影响[24]，因此在黑莓加工和储藏过程中，与其相关的色变成影响产品质量的重要因素。

红茶菌发酵黑莓汁过程中花色苷含量的变化如图4所示。由图4可知：未发酵黑莓汁中花色苷质量浓度为6.24 mg/L，随着时间的延长，未发酵和发酵的黑莓汁中花色苷的含量显著降低，且37 ℃时黑莓汁中花色苷的含量显著低于28 ℃时黑莓汁中花色苷的含量。有研究表明温度会影响花色苷的稳定性，随着温度的升高，花色苷降解速度加快，并且在储藏过程中花色苷的降解遵循一级化学反应动力学[15]。在pH为2～4时，温度升高可以诱导花色苷的糖苷键水解，形成查尔酮形式[24]。

当发酵温度为28 ℃、发酵20 d时，红茶菌发酵黑莓汁和未发酵黑莓汁中花色苷质量浓度分别为4.53和1.86 mg/L；当发酵温度为37 ℃、发酵20 d后，红茶菌发酵黑莓汁和未发酵黑莓汁中花色苷质量浓度分别为2.53和0.79 mg/L；相同发酵温度和发酵天数下，红茶菌发酵黑莓汁中花色苷含量显著高于未发酵黑莓汁中花色苷含量。花色苷结构随溶液的pH变化会发生改变，同时，溶液的颜色也随结构的改变而改变[22]。徐金瑞等[25]发现：当溶液pH<3时，花色苷主要以烊盐形式存在；当pH升高，花色苷烊盐受到水分子亲和攻击并且花色苷上的酸性羟基会发生质子转移，因此低pH对防止花色苷降解具有重要作用。同时由图2可知：未发酵的黑莓汁pH为3.20左右，高于发酵黑莓汁的pH，由此可见，低pH发酵能有效防止黑莓汁中花色苷降解。

有机酸可以与花色苷相互作用起到增色效应[26]。Tsukui等[27]研究发现醋酸含量的增加会引起花青素吸光度的增加。Kwaw等[28]也发现乳酸发酵能够提高桑葚汁中花青素的含量。与未发酵的黑莓汁相比，发酵黑莓汁乙酸和乳酸含量增加(表4)，由此可知，在红茶菌发酵黑莓汁过程中，有机酸含量的增加能够在一定程度上防止花色苷的降解。

图4 红茶菌发酵黑莓汁过程中花色苷含量的变化Fig.4 Changes of anthocyanin content in Kombucha-fermented blackberry juice

3 结论

本文研究了红茶菌发酵黑莓汁过程中理化指标的变化。与未发酵黑莓汁相比，红茶菌发酵能够使黑莓汁pH、蔗糖、葡萄糖、果糖、草酸、L-苹果酸及花色苷含量降低，而使L*、a*和b*值及多糖、乳酸和乙酸含量增加。在28 ℃时发酵黑莓汁中醋酸菌是优势菌，而37 ℃时乳酸菌为优势菌。相同发酵时间下，在28 ℃时发酵黑莓汁的pH及蔗糖、果糖和乳酸含量低于37 ℃时的发酵黑莓汁，但L*、a*和b*值及多糖、乙酸和花色苷含量高于37 ℃时发酵的黑莓汁。

本研究选用容易腐烂、鲜食货架期较短的黑莓为原料，通过红茶菌发酵的方式赋予黑莓汁独特的风味，提高了其功能价值，为该产品后续深入开发提供一定的理论基础，并能在一定程度上促进黑莓加工产业的可持续发展。