研究表明，芳香化酶抑制剂能够减少生长期体内雄激素向雌激素的转化，抑制生长板软骨细胞凋亡，从而起到延缓骨骺闭合，促进身高增长的目的

。而7-羟基黄烷酮作为一种天然产物黄酮类化合物，具有较好的芳香化酶抑制作用

。前期的实验发现其具有抑制生长板软骨细胞凋亡的效果，但是最佳药物浓度尚无定论

。因此本研究对其抑制生长板软骨细胞凋亡的最佳药物浓度进行筛选，并对其延迟骨骺闭合促进长骨生长进行验证，为该药物的临床使用及后续实验提供一定研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器1.1.1 主要试剂 0.25%胰蛋白酶，胎牛血清，IL-1β，来曲唑，7-羟基黄烷酮，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒MTT，胶原蛋白酶Ⅱ，台盼蓝染色液，曲拉通，4'，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐DAPI溶液，二甲基亚砜DMSO，封闭山羊血清，流式细胞术ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，Ⅱ型胶原抗体Collagen Type ⅡAntibody，荧光封片剂Fluoromount-G。

本文将该滑坡的物理介质概化成滑体土与滑床基岩两种介质，基于FLAC3D数值分析平台和该滑坡的几何形态特征，构建的数值模型如图10所示。其中，滑体表面的102、100号点分别对应着JCD-1、JCD-2地表GPS监测点。

1.1.2 主要仪器 细胞培养孔板，电子天平，恒温水浴锅，37 ℃恒温细胞培养箱，电热恒温震荡水槽，立式压力蒸汽灭菌器，高速离心机，高级分析倒置显微镜，流式细胞仪，多功能酶标仪，血球计数板。

1.2 实验方法

1.2.3 流式细胞仪验证7-羟基黄烷酮对IL-1β引起细胞凋亡的抑制作用 取培养的对数期生长板软骨细胞，以正常培养的细胞为正常对照组；以20 ng/mL IL-1β诱导每孔细胞凋亡为模型对照组；以加入来曲唑为阳性对照组；以加入40 μM 7-羟基黄烷酮为7-羟基黄烷酮组，各组培养24 h。悬浮弃上清。然后用1mL Binding Buffer重悬细胞。每管加入100 μL细胞（1×10

个）。再向管中加入5 μL Annexin V-FITC。室温避光，混匀10 min。加入5 μL PI，室温避光，孵育5 min。加入PBS至500 μL，混匀。1 h内用流式细胞仪检测。观察各组细胞凋亡情况，并统计细胞凋亡率。

1.2.1 羊水染色体核型分析 在无菌操作条件下抽取羊水约10ml，并进行接种、培养、收获、制片、G显带及核型分析。

2.2 7-羟基黄烷酮抑制生长板软骨细胞凋亡的初步药物浓度筛选 溶剂组及非造模＋用药组软骨细胞活率与正常组差异均无统计学意义，培养24 h的10、20、40、60 μM 7-羟基黄烷酮均对生长板软骨细胞的凋亡有抑制作用，与模型组比较差异均有高度统计学意义（

＜0.01），且作用比阳性对照组好，差异有高度统计学意义（

＜0.01）。其中最佳的药物浓度为40 μM，见表1。

2013年1月至2015年12月我院对冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)患者150例开展了分析研究,患者临床中都有典型的冠心病症状,使用各种诊断方式均确诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病[3-4]。全部患者共有71例女性患者和79例男性患者,患者最小是55岁,最大是86岁,平均(71.87±13.62)岁。此次我们就患者的临床病例资料开展了分析比较,患者对此次研究知情且同意参与。

1.2.4 7-羟基黄烷酮对大鼠骨骺闭合及胫骨生长的影响 36只4周龄雌性SD大鼠分为正常对照组、阳性对照组及用药组，每组各12只。正常对照组每天灌胃去离子水。阳性对照组每天灌胃0.325 mg/kg来曲唑，用药组每天灌胃100 mg/kg 7-羟基黄烷酮。正常组每15 d拍摄X线片观察骨骺闭合情况，当正常组闭合数量超过2/3时，对阳性对照组及用药组同时拍摄X线片观察骨骺闭合例数并进行记录。当所有大鼠骨骺均闭合后采用脱颈椎法处死大鼠，使用游标卡尺测量胫骨长度，进行各组间比较。

在拍摄前最好查一下天气条件是否合适。这个场景中的暗沉天空为James的照片定下了硬朗的基调。没有这种天气，涂鸦的背景和粗犷感就不会如此突出。

2.1 软骨细胞免疫荧光鉴定结果 Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的特异性胶原，可利用其免疫荧光对软骨细胞进行鉴定

。大鼠生长板软骨细胞经培养72 h后进行免疫荧光实验，结果显示，在荧光倒置相差显微镜下，细胞核经DAPI染色后在不同波段荧光激发出蓝色荧光，见图1A，细胞质被激发出清晰红色荧光，见图1B。表明分离培养的细胞表达特征性Ⅱ型胶原，符合软骨细胞的生物学特征，证明本实验方法能够分离培养出纯度较高的软骨细胞，可供进一步实验研究使用。

2 结果

1.2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计学分析。对不同浓度7-羟基黄烷酮对生长板软骨细胞的凋亡影响比较及大鼠胫骨生长长度的影响比较采用单因素方差分析，对大鼠胫骨平台骨骺闭合例数影响的比较采用χ

检验，以

＜0.05为差异有统计学意义。

1.2.1 大鼠生长板软骨细胞分离培养及鉴定 2只4周龄雌性SD大鼠处死体外分离胫骨生长板软骨，冲洗并充分剪碎。加入2 mL 1%Ⅱ型胶原酶，37 ℃水浴锅振荡5 h后，过滤离心5 min后收集细胞沉淀PBS清洗2次。完全培养基反复吹打混匀制成细胞悬液。血球计数板计数，台盼蓝染色测定细胞的活力。将悬液接种到装有含10%胎牛血清DMED/F12培养液的T25培养瓶中，置于37 ℃含体积百分数为5%的CO

培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，每2 d换液1次。当细胞接近80%～90%汇合时进行传代。取传代的细胞爬片于24孔板中，每孔加入培养基1 mL，加入细胞1×10

个/孔，置于培养箱中过夜培养。细胞爬片后，吸出培养基PBS洗1遍，加入PFA于4 ℃固定30 min。用PBS洗3×5 min/次。最后一次不吸出PBS，4 ℃过夜。除去玻片水分并用封闭液封闭。阳性玻片一抗孵育过夜，阴性玻片不孵育一抗。二抗避光孵育2 h后PBS洗3×5 min/次，染DAPI5min，PBS洗3×5 min/次。玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。进行细胞鉴定。

1.2.2 MTT法初步观察7-羟基黄烷酮对生长板软骨细胞培养的影响 取对数期生长的大鼠生长板软骨细胞消化处理后，按1×10

/孔接种于96孔板，置于37 ℃，5% CO

培养箱，正常培养的细胞为正常对照组；模型对照组和阳性对照组加入20 ng/mL IL-1β诱导细胞凋亡，阳性对照组中同时加入5 μm来曲唑；以配制药物的DMSO溶液为溶剂组；以正常细胞加入浓度为40 μM 7-羟基黄烷酮为非造模＋用药组；以加入20 ng/mL IL-1β的同时分别加入浓度为10、20、40、60 μM 7-羟基黄烷酮的培养液为实验1～4组。每孔200 μL，每组设6个复孔。置于37 ℃，5% CO

培养箱分别培养24 h和48 h后，取出96孔板，将20 μL MTT溶液加入到每个培养孔中，继续培养4 h后，取出96孔板，吸除培养基，每孔加入150 μL Formazan溶液，置摇床上低速振荡30 min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在OD 570 nm处测量各孔的吸光值。

支撑架(图2)的作用首先是用于承受压装时装置所受的的轴向载荷，在装置吊运时承受整个装置的重力，要求结构呈360°等分，刚度大。为此我们设计成采用Q235材料的工字型的六根梁，并且在两边各焊了25 mm厚的Q235钢板作为加强筋，焊后去应力退火。其次，支撑架将作为液压站、拉杆连接套、电接点压力表、吊耳等的载体，面积较大，我们将这些零部件，均匀地布置在支撑架的上方，避免吊运时发生倾斜。

2.3 流式细胞仪验证7-羟基黄烷酮对IL-1β引起细胞凋亡的抑制作用 流式细胞仪检验结果显示，正常组几乎均为正常活细胞，模型组各时期凋亡细胞较多，阳性对照组可以抑制生长板软骨细胞凋亡，而7-羟基黄烷酮组效果略优于阳性对照组，见图2。在细胞凋亡率方面也得到相同结果，见图3。

2.4 7-羟基黄烷酮对大鼠骨骺闭合及胫骨生长的影响 当模型组大鼠胫骨平台骨骺闭合例数超过2/3 时，用药组及阳性对照组的骨骺闭合例数均少于模型组（

＜0.01），见表2。通过对同一时间点模型组与用药组及阳性对照组大鼠胫骨平台X线片显示，模型对照组大鼠骨骺闭合，而用药组及阳性对照组大鼠骨骺未闭合。最终对大鼠胫骨长度测量，结果显示用药组大鼠胫骨长度长于模型对照组及阳性对照组（

＜0.05），见表3。

3 讨论

骨骼增长结束的标志是骨骺闭合，而骨骺闭合以生长板软骨细胞的凋亡为直接诱因，由生长后期过高的雌激素导致

。雌激素是女性主要的性激素，主要由卵巢分泌或雄性激素经芳香化酶转化而来

。女性身体中的部分和男性身体中的大部分雌激素都是以雄激素为来源，从皮肤、脂肪、神经等周边组织由芳香化酶转化而来

。因此，如果能抑制芳香化酶将雄激素转化为雌激素，理论上就能够减少生长板软骨细胞凋亡，延缓骨骺闭合，促进身高增长。芳香化酶是细胞色素P450酶系中的一种混合功能氧化酶，其主要作用是将睾酮和雄烯二酮转化为雌二醇和雌酮，即雄激素向雌激素的转变

；而芳香化酶抑制剂（AIS）可以抑制这一反应，从而降低向雌激素转化，进而达到延缓骨骺闭合的目的。由于芳香化反应是类固醇激素生物合成过程中独特的反应，而且雌激素是这种反应的最终产物，因此芳香化酶抑制所导致的雌激素减少不会影响其他类固醇激素的产生，故AIS可以应用于临床

，例如第三代非甾体类AIS来曲唑，具有高选择性、可逆性和高效性等特点，目前已广泛应用于乳腺癌、子宫内膜癌以及青春期特发性身材矮小男童的等疾病治疗当中

，因此，研发新一代效果好、不良反应少的芳香化酶抑制剂成为研究的热点。

天然产物一直是创新药物及其先导化合物的来源之一，具有化学种类多、结构新颖等特点

，其中7-羟基黄烷酮作为天然黄酮类化合物的一种，研究发现其具有较好的芳香化酶抑制作用，但对于其最适药物浓度，临床上尚无统一定论

。因此，本次研究对7-羟基黄烷酮抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡的最适药物浓度进行筛选。我们首先采用倒置相差显微镜及Ⅱ型胶原免疫荧光实验对分离的大鼠生长板软骨细胞进行鉴定，从而为后续实验提供基础。随后建立正常对照组、模型对照组、阳性对照组、溶剂组、非造模＋用药组以及实验1～4组并对各组软骨细胞凋亡情况进行比较。最终得到抑制大鼠软骨细胞凋亡的最佳药物浓度为40 μM，同时通过体外动物实验证实，7-羟基黄烷酮的确能够延缓骨骺闭合，从而促进胫骨生长。基于此，我们认为本次实验证实7-羟基黄烷酮能够延缓大鼠骨骺闭合，促进胫骨增长，其机制可能与通过药物抑制芳香化酶反应，从而降低雌激素转化，进而抑制生长板软骨细胞凋亡有关。而在7-羟基黄烷酮抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡，最适药物浓度筛选中，40 μM浓度效果最佳，这也为今后该药物应用临床提供了实验数据和理论支持。

综上所述，本次研究结果显示，7-羟基黄烷酮能够抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡，最适药物浓度为40 μM。此外，体外实验证实给予大鼠灌胃7-羟基黄烷酮的确能够延缓骨骺愈合，促进胫骨生长。

[1] 欧阳力雪，杨凡.芳香化酶抑制剂在矮身材青少年男童中的应用研究进展[J].中华实用儿科临床杂志，2020，35（9）：712-715.

[2] 徐文珊，黄鸣清，陈修平，等.天然产物来源的芳香化酶抑制剂研究进展[J].时珍国医国药，2012，23（4）：1008-1011.

[3] SANDERSON J T，HORDIJK J，DENISON M S，et al.Induction and inhibition of aromatase （CYP19） activity by natural and synthetic flavonoid compounds in H295R human adrenocortical carcinoma cells[J].Toxicol Sci，2004，82（1）：70-79.

[4] 高伟华，李玉杰，杨鸿冉，等.加味阳和汤对膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响研究[J].中国中医骨伤科杂志，2021，29（1）：1-5，10.

[5] BAEK D，LEE K M，PARK K W，et al . Inhibition of miR-449a Promotes Cartilage Regeneration and Prevents Progression of Osteoarthritis in In Vivo Rat Models[J].Mol Ther Nucleic Acids，2018（13）：322-333.

[6] KANG B H，CHO J H，KIM S Y，et al.Growth and Bone Mineral Density Changes in Ovariectomized Rats Treated with Estrogen Receptor Alpha or Beta Agonists[J].J Korean Med Sci，2020，35（45）：e370.

[7] AWASTHI M，SINGH S，PANDEY V P，et al.Molecular docking and 3D-QSAR-based virtual screening of flavonoids as potential aromatase inhibitors against estrogen-dependent breast cancer[J].J Biomol Struct Dyn，2015，33（4）：804-819.

[8] KONG Y，CHEN H，LIANG L，et al.Aromatase inhibitors combined with growth hormone in treatment of adolescent boys with short stature[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2020，25，49（3）：283-290.

[9] 钟救根，侯晓晖，兰号.芳香化酶抑制剂相关关节痛研究进展[J].中国康复理论与实践，2019，25（7）：805-812.

[10] 王阳，李伟鹏，李政，等.芳香化酶抑制剂治疗男性不育症的研究进展[J].中华泌尿外科杂志，2019，40（10）：798-800.

[11] 乔晓红.芳香化酶抑制剂在儿科领域应用研究进展[J].世界临床药物，2020，41（3）：160-165.

[12] 林娟，马华梅，李燕虹，等.来曲唑对青春早中期男童生殖功能与线性生长的近期影响[J].中山大学学报（医学版），2018，39（3）：386-392.

[13] 孟春艳，张付菊，苏永平.来曲唑在乳腺癌辅助内分泌治疗中的研究进展[J].癌症进展，2021，19（5）：438-441.

[14] 豆竹丽，阮祥燕，鞠蕊，等.综合干预后多囊卵巢综合征不孕患者应用来曲唑促排卵的临床效果[J].首都医科大学学报，2020，41（4）：525-529.

[15] 崔蕴璞，王新利.来曲唑治疗青春期特发性矮身材男童的临床观察[J].中国当代儿科杂志，2019，21（10）：977-982.

[16] 李坤，杨义芳.天然产物及其衍生物中的芳香化酶抑制剂[J].中草药，2008，39（9）：1417-1424.

[17] 付志鹏，周忠霞，刘新泳，等.天然产物抗病毒药物的研究进展[J].药学学报，2020，55（4）：703-719.